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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物高GC，pcr体系怎么调整
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好孩子坏孩子

金虫 (著名写手)

[交流] 引物高GC，pcr体系怎么调整 已有4人参与

扩增一段cds区域，片段GC含量在50％左右，但是引物区GC含量在80％左右，用了takara的premerstar酶进行扩增，退火温度58度，只能扩增出杂带，没有目的片段，请问这种情况，应该怎么调整pcr体系和条件呢？求大神帮助

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1楼 2019-12-12 00:13:22
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wuyuanqing

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-01-12 21:19:22
添加合适GC缓冲液；适当延长引物；退火温度设置梯度；换酶。

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好孩子坏孩子
2楼2019-12-12 07:23:05
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1272356152

新虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-01-12 21:19:33
考虑片段大小，模板类型，更换扩增酶

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好孩子坏孩子
3楼2019-12-12 12:55:30
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好孩子坏孩子

金虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuyuanqing at 2019-12-12 02:23:05
添加合适GC缓冲液；适当延长引物；退火温度设置梯度；换酶。

好的

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4楼2019-12-13 00:20:04
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好孩子坏孩子

金虫 (著名写手)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 1272356152 at 2019-12-12 07:55:30
考虑片段大小，模板类型，更换扩增酶

我试试

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5楼2019-12-13 00:20:18
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叶耶耶0759

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好  你的引物高CG含量扩增成功了吗   我现在遇到同样问题了  可以分享下解决办法嘛

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6楼2020-01-10 19:10:51
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好孩子坏孩子

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 叶耶耶0759 at 2020-01-10 14:10:51
你好  你的引物高CG含量扩增成功了吗   我现在遇到同样问题了  可以分享下解决办法嘛

分别在之前设计引物的上下游分别设计的引物，避开了高GC区

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7楼2020-01-11 07:01:45
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by 好孩子坏孩子 at 2020-01-11 07:01:45
分别在之前设计引物的上下游分别设计的引物，避开了高GC区
...

换地方设计引物可以，使用takara的Gflex polymerase之类的酶也行，还有他家的GC buffer也可以试一下。
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8楼2020-01-11 12:32:16
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