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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教质粒拷贝数低的问题
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anik

银虫 (正式写手)

[交流] 请教质粒拷贝数低的问题

做植物转基因方面的，由于表达载体拷贝数过低，在提取质粒时提取出来的量也很少，无法做切胶回收片断。
我的问题是，你们是怎样处理这个问题的？


我用碱法提取，菌液成倍增加，提取的质粒量也没有明显的变化，条带很弱，无法进行下续试验。
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1楼 2009-06-11 09:04:36
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
amisking(金币+0,VIP+0):欢迎发帖交流！ 6-11 19:07
你没有说明你的目的，你要是只想要段的话直接PCR扩增出来就可以了。大量提质粒并不是单单增加菌液就可以的，你的体系也需要放大，但是这样一来操作就比较麻烦。最简单的方法就是多做几管，然后抽提浓缩。另外一个麻烦些的方法就是重新克隆到一个克隆载体，这样就能稳定的得到大量的外源片段了。
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金币是赌出来的
2楼2009-06-11 09:21:50
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我觉得主要是看楼主你抽出的质粒要干什么？
做个PCR应该没有问题的，如果后面有对浓度和纯度高的实验那么建议买个Kit算了，Kit的效率肯定会好很多。
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3楼2009-06-11 09:41:27
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anik

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by wjswj at 2009-6-11 09:21:
你没有说明你的目的，你要是只想要段的话直接PCR扩增出来就可以了。大量提质粒并不是单单增加菌液就可以的，你的体系也需要放大，但是这样一来操作就比较麻烦。最简单的方法就是多做几管，然后抽提浓缩。另外一个 ...

[

呵呵，你讲的这些我都知道。
转基因方面的表达质粒的拷贝数都是比较低的。
十几KB的质粒PCR做什么用呢？

多做几管浓缩，这是个方法。但是目前我的实验条件没有浓缩仪。。。。所以之个头疼的问题啊
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4楼2009-06-11 14:38:33
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anik

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by charlies929 at 2009-6-11 09:41:
我觉得主要是看楼主你抽出的质粒要干什么？
做个PCR应该没有问题的，如果后面有对浓度和纯度高的实验那么建议买个Kit算了，Kit的效率肯定会好很多。

即使用KIT也提不出我想要的量阿，质粒的拷贝数本身就很低的。

提取质粒做酶切，然后回收。质粒的拷贝数低，量少，无法继续下续实验。
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5楼2009-06-11 14:40:44
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xmchen1015

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
要看低到什么程度，如果提出来的质粒总量能达到1ug，就完全可以进行酶切，回收来做下一步的载体，我们做连接时载体都用50-100ng.
如果再低的话，我们用一种中提质粒的kit,一次可以提300ml的菌。
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6楼2009-06-11 16:40:37
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smurfen

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
植物表达的载体在大肠中拷贝数比较高吧
pBI和pCAMBIA的质粒碱法应该都能提得比较亮呢
不过最好用个Kit啦
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Advances in Prevention of Thermal Runaway in Lithium-Ion Batteries
7楼2009-06-11 17:18:53
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anik

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by smurfen at 2009-6-11 17:18:
植物表达的载体在大肠中拷贝数比较高吧
pBI和pCAMBIA的质粒碱法应该都能提得比较亮呢
不过最好用个Kit啦

pBI表达的都不高的阿，我提出来的条带都不是很亮，碱法和KIT提出来的都是比较弱的条带。
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8楼2009-06-11 18:34:55
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
先提出来，转到大肠杆菌中，再提出来做研究
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9楼2009-06-11 21:11:05
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
质粒浓缩不需要浓缩仪的啊。只要沉淀了，晾干就可以了啊，再用水溶了就好。
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金币是赌出来的
10楼2009-06-12 09:36:55
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