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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 色谱质谱 » 【求助】新手对于RP-HPLC分离肽的一些疑问？
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sungw1984

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助】新手对于RP-HPLC分离肽的一些疑问？

我最经在做大豆7S蛋白水解物的分离纯化，原本是打算先过凝胶层析再RP-HPLC的，后因为凝胶柱得到样品过少，且时间很紧迫，于是打算水解产物直接上液相，用的是C18的制备柱250*10mm，A相0.1%TFA，B相60%乙腈0.1%TFA，上样2ml，浓度50mg/ml，流速3ml/min，上样后先用10~15分钟的A相把未吸附的样品洗下，然后梯度洗脱：0~60min：0~100%B；60~75min：100%B；75~85min：0~100%A，这是摸索条件时的洗脱方法，但是做了N次，无法得到比较好的分离度，都是一坨一坨出来的，基本没有尖锐的峰且连成片，连着做了2天了，流动相用了N多，却仍然找不到一个好的洗脱条件…… 请问：水解液不经过初步的分离（如凝胶过滤、离子交换等等）直接上液相，理论上能分开吗？如果能，条件改如何优化？如果不能，是否因为成分太复杂，无法达到要求的分辨率？我是个色谱新手，以前基本没怎么做过这方面的实验，所以比较菜……

另外，每次梯度洗脱后恢复初始条件的时候（0~100%A) 为什么吸收会到负的，就是有个较大的负吸收峰，是因为流动相的吸光值差异引起的吗？
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1楼 2009-06-10 22:23:33
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hfl109

金虫 (正式写手)
用分析柱    减少进样量，把2ml改为30ul，20ul 10ul 试试！

[ Last edited by hfl109 on 2009-6-11 at 08:41 ]
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2楼2009-06-11 08:40:28
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weipingwu

金虫 (正式写手)
你的浓度太高了，超载了。。。。
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不经历风雨，怎能见彩虹？
3楼2009-06-11 08:42:24
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sungw1984

木虫 (小有名气)
可以我是要制备啊…… 还要分别测活性  后面还要打质谱  分析柱做的量太少了啊
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4楼2009-06-11 08:44:57
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sungw1984

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by weipingwu at 2009-6-11 08:42:
你的浓度太高了，超载了。。。。

250*10mm 算是制备或者半制备柱吧 这个浓度也高了吗？

我看一些文章里面 浓度跟我差不多的啊
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5楼2009-06-11 08:46:38
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zhxinyzu

铁杆木虫 (正式写手)
C18的制备柱250*10mm颗粒粒径多少的，用小点粒径填料试试
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6楼2009-06-11 10:34:30
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sungw1984

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhxinyzu at 2009-6-11 10:34:
C18的制备柱250*10mm颗粒粒径多少的，用小点粒径填料试试

我们实验室只有这两种规格的C18柱
Kromasil C18 12 μm ST, 10/250

Kromasil C18 12 μm ST 4.6/250
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7楼2009-06-11 10:51:11
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gm_night

金虫 (小有名气)
★
sungw1984(金币+1,VIP+0):可是我们实验室只有这两种C18柱…… 6-11 14:27
It is likely you have load too much sample and your column can not separate them.
You can use a similar analytical column to see the peak shape and then transfter to semi or preparative column.
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8楼2009-06-11 11:08:03
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sungw1984

木虫 (小有名气)
想知道  分不开 是不是 与 样品中的成分太复杂有关 因为毕竟没有经过一些其他的分离步骤
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9楼2009-06-11 14:45:27
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sungw1984

木虫 (小有名气)
Kromasil C18 10 μm ST, 10/250

Kromasil C18 5 μm ST 4.6/250

上面的数据错了……寒个 刚去仔细看了下
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10楼2009-06-12 16:56:26
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