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sungw1984木虫 (小有名气)
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【求助】新手对于RP-HPLC分离肽的一些疑问？
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我最经在做大豆7S蛋白水解物的分离纯化，原本是打算先过凝胶层析再RP-HPLC的，后因为凝胶柱得到样品过少，且时间很紧迫，于是打算水解产物直接上液相，用的是C18的制备柱250*10mm，A相0.1%TFA，B相60%乙腈0.1%TFA，上样2ml，浓度50mg/ml，流速3ml/min，上样后先用10~15分钟的A相把未吸附的样品洗下，然后梯度洗脱：0~60min：0~100%B；60~75min：100%B；75~85min：0~100%A，这是摸索条件时的洗脱方法，但是做了N次，无法得到比较好的分离度，都是一坨一坨出来的，基本没有尖锐的峰且连成片，连着做了2天了，流动相用了N多，却仍然找不到一个好的洗脱条件…… 请问：水解液不经过初步的分离（如凝胶过滤、离子交换等等）直接上液相，理论上能分开吗？如果能，条件改如何优化？如果不能，是否因为成分太复杂，无法达到要求的分辨率？我是个色谱新手，以前基本没怎么做过这方面的实验，所以比较菜…… 另外，每次梯度洗脱后恢复初始条件的时候（0~100%A) 为什么吸收会到负的，就是有个较大的负吸收峰，是因为流动相的吸光值差异引起的吗？ |
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