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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 如何在排除缓冲液干扰的前提下测定蛋白是否含金属离子
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)

[求助] 如何在排除缓冲液干扰的前提下测定蛋白是否含金属离子

蛋白存在于缓冲液中（含钠离子），用ICP法测定的是溶液总的元素含量，不能分辨离子（钠离子）是不是来自于蛋白质，如果用透析的办法能完全除去缓冲液中的离子吗，或者冷冻干燥获得蛋白干粉会不会还带有溶液中的离子呢？知识有限，求助大家用什么方法可以只测蛋白里面的金属离子，谢谢各位
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1楼 2019-11-11 11:16:01
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zsygxh

金虫 (小有名气)
不了解你所用的方法。想去除钠离子，冷冻干燥肯定不行，冷冻干燥只能去除水和可挥发性成分，钠盐最后会析出与蛋白干粉共存。透析理论上是无法完全去除某一组分的，但通过多次换液，可以让某一组分趋近于0（但不等于0），相当于稀释。虽然无法完全去除钠离子，但仍然可以通过透析达到你的实验目的。要知道即使多个蛋白分子与一个金属离子形成配位键，通常蛋白分子的个数也是个位数，所以如果你溶液里面的钠离子的摩尔浓度比蛋白的摩尔浓度低几个数量级，那么假设是蛋白结合的钠离子，检测得到的钠离子的量会远高于你透析后计算的理论量。透析尽量多换几次液。
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2楼2019-11-11 15:36:24
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zsygxh

金虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by zsygxh at 2019-11-11 15:36:24
不了解你所用的方法。想去除钠离子，冷冻干燥肯定不行，冷冻干燥只能去除水和可挥发性成分，钠盐最后会析出与蛋白干粉共存。透析理论上是无法完全去除某一组分的，但通过多次换液，可以让某一组分趋近于0（但不等于 ...

或者蛋白样品过分子筛脱盐换液
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3楼2019-11-11 15:38:22
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by zsygxh at 2019-11-11 15:38:22
或者蛋白样品过分子筛脱盐换液...

我的理解是 既然透析无法完全去除钠离子，仪器的精密度那么高肯定是可以检测出来的，那还是不能说明钠离子来源。另外您说的过分子筛脱盐，可以完全置换掉缓冲液吗，我用过Millipore超滤离心管除盐离子，不知道是不是一样能用，谢谢您的回复
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4楼2019-11-11 19:25:42
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zsygxh

金虫 (小有名气)
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4楼: Originally posted by Cherishqj at 2019-11-11 19:25:42
我的理解是 既然透析无法完全去除钠离子，仪器的精密度那么高肯定是可以检测出来的，那还是不能说明钠离子来源。另外您说的过分子筛脱盐，可以完全置换掉缓冲液吗，我用过Millipore超滤离心管除盐离子，不知道是不 ...

超滤离心换液本质上跟透析是一样的，都是降低离子浓度。举例来讲，比如你的蛋白体积10ml，钠离子浓度100mM,透析到1Lbuffer中，理论浓度变成1mM，再换液透析至1L buffer 中，浓度降至10uM,再换液……4次换液理论上钠离子浓度稀释了1亿倍（实际可能达不到），含量是极低的，如果仪器的灵敏度很高，这种浓度都能检测到的话，继续透析，直至低于仪器可识别范围。另外，如果蛋白结合钠离子，那么会有一个比例，比如1分子蛋白结合1分子钠离子，那么当透析到一定浓度后，不管再怎么透析，钠离子浓度几乎不再变化，你可以比较不同透析倍数的钠离子浓度也能判断。不推荐超滤离心换液，因为很可能影响蛋白稳定性，发生聚集。分子筛换液也是一种实验室规模常用的方法，脱盐柱就是一种较粗糙的分子筛，你要求高最好使用纯化用的分子筛，用长度高一点的柱子，大分子先出，小分子很晚才出。
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5楼2019-11-12 12:07:29
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Cherishqj

铜虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by zsygxh at 2019-11-12 12:07:29
超滤离心换液本质上跟透析是一样的，都是降低离子浓度。举例来讲，比如你的蛋白体积10ml，钠离子浓度100mM,透析到1Lbuffer中，理论浓度变成1mM，再换液透析至1L buffer 中，浓度降至10uM,再换液……4次换液理论上钠 ...

谢谢您的解释，我明白了。我们实验室目前只有透析袋，我先尝试透析吧
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6楼2019-11-12 15:05:51
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