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ap372767129铁虫 (正式写手)
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[求助]
重组蛋白表达后没有酶活力已有1人参与
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各位大神： 我在pET-20b（+）构建的一段多糖水解酶基因，但是在25℃条件下分泌表达后，用镍柱纯化，经蛋白电泳验证能证明发酵液和周质空间中的酶蛋白已表达，由于上样是上清液，能排除是包涵体特征，但是纯化的酶没有酶活力，电泳图如下（最右侧那条粗条带是发酵液中的酶经镍柱纯化后的结果，细胞破壁纯化也有一粗条带）。 我目前有几个疑问：文献中报的这个酶表达是在pET15b中，该载体没有信号肽，是在20℃条件下的胞内诱导表达。而我的载体是pET20b（+）是有信号肽的，酶蛋白会被分泌至周质空间也有部分渗漏至发酵液中，不过我的发酵温度是25℃。我想问是因为发酵温度导致的酶蛋白折叠不正确导致没有酶活力还是该酶本应该在胞内表达才有活力（该酶本身是胞内酶，来源没有信号肽）。之前不表达的问答题刚刚解决又遇到没有活力的问题，请各位老师同学指点迷津。 |
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