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卡那抗性基因老扩不出来，大家出出注意
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我以pET-28a为模板扩增卡那抗性基因用于插入片断，设计引物的时候两端需要引入酶切位点salI，我的引物碱基是从卡那基因的左右两头取的，加入保护碱基和酶切位点，但是扩出来的片断酶切后进行连接老连不上，我就把它简单连接T载体也不能在含卡那的平板上长，是不是引物设计的问题，大家帮我看看.。 引物： Kan-F:M ACGC GTCGAC GTATCTCAGTTCG GTGTAG Kan-R:M ACGC GTCGAC GGTGGCACTT TTCGGGG 保护碱基4个＋酶切位点＋引物序列 pET-28a的卡那序列为： Promoter of the KanR from the RC sequence of pEtac 3748 GTA TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA 3781 GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA 3841 TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA 3901 CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA 3961 CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC CAGTTACCTT 4021 CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT 4081 TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT 4141 CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT 4201 GAACAATAAA ACTGTCTGCT TACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTT 4247 Full sequence of the KanR from the RC sequence of pEtac 3748 GTA TCTCAGTTCG GTGTAGGTCG TTCGCTCCAA 3781 GCTGGGCTGT GTGCACGAAC CCCCCGTTCA GCCCGACCGC TGCGCCTTAT CCGGTAACTA 3841 TCGTCTTGAG TCCAACCCGG TAAGACACGA CTTATCGCCA CTGGCAGCAG CCACTGGTAA 3901 CAGGATTAGC AGAGCGAGGT ATGTAGGCGG TGCTACAGAG TTCTTGAAGT GGTGGCCTAA 3961 CTACGGCTAC ACTAGAAGGA CAGTATTTGG TATCTGCGCT CTGCTGAAGC CAGTTACCTT 4021 CGGAAAAAGA GTTGGTAGCT CTTGATCCGG CAAACAAACC ACCGCTGGTA GCGGTGGTTT 4081 TTTTGTTTGC AAGCAGCAGA TTACGCGCAG AAAAAAAGGA TCTCAAGAAG ATCCTTTGAT 4141 CTTTTCTACG GGGTCTGACG CTCAGTGGAA CGAAAACTCA CGTTAAGGGA TTTTGGTCAT 4201 GAACAATAAA ACTGTCTGCT TACATAAACA GTAATACAAG GGGTGTTATG AGCCATATTC 4261 AACGGGAAAC GTCTTGCTCT AGGCCGCGAT TAAATTCCAA CATGGATGCT GATTTATATG 4321 GGTATAAATG GGCTCGCGAT AATGTCGGGC AATCAGGTGC GACAATCTAT CGATTGTATG 4381 GGAAGCCCGA TGCGCCAGAG TTGTTTCTGA AACATGGCAA AGGTAGCGTT GCCAATGATG 4441 TTACAGATGA GATGGTCAGA CTAAACTGGC TGACGGAATT TATGCCTCTT CCGACCATCA 4501 AGCATTTTAT CCGTACTCCT GATGATGCAT GGTTACTCAC CACTGCGATC CCCGGGAAAA 4561 CAGCATTCCA GGTATTAGAA GAATATCCTG ATTCAGGTGA AAATATTGTT GATGCGCTGG 4621 CAGTGTTCCT GCGCCGGTTG CATTCGATTC CTGTTTGTAA TTGTCCTTTT AACAGCGATC 4681 GCGTATTTCG TCTCGCTCAG GCGCAATCAC GAATGAATAA CGGTTTGGTT GATGCGAGTG 4741 ATTTTGATGA CGAGCGTAAT GGCTGGCCTG TTGAACAAGT CTGGAAAGAA ATGCATAAAC 4801 TTTTGCCATT CTCACCGGAT TCAGTCGTCA CTCATGGTGA TTTCTCACTT GATAACCTTA 4861 TTTTTGACGA GGGGAAATTA ATAGGTTGTA TTGATGTTGG ACGAGTCGGA ATCGCAGACC 4921 GATACCAGGA TCTTGCCATC CTATGGAACT GCCTCGGTGA GTTTTCTCCT TCATTACAGA 4981 AACGGCTTTT TCAAAAATAT GGTATTGATA ATCCTGATAT GAATAAATTG CAGTTTCATT 5041 TGATGCTCGA TGAGTTTTTC TAAGAATTAA TTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT 5101 TAGAAAAATA AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC GAAAAGTGCC ACC 5153 大家帮忙看看引物设计有没有问题，引物有发夹结构但是自由能不大，二者互补也不严重，构建载体最后一步就是连卡那抗性，连了几次都没成功，头疼呀。 |
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