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Western Blot（WB）操作中需要注意事项与结果不理想可能的原因自查
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第一部分 WB操作中需要注意事项 一、蛋白样品的准备 1、样品质量 所抽取样品的蛋白含量，蛋白变性是否充分等等，还有，蛋白样品的PH值是否在7~8之间。这会直接影响到样品浓缩的效果。此外，蛋白样品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的可靠性有影响。 2、细胞水平要做WB，多少细胞提的蛋白够做WB 一般5×106就足够 3、小分子量蛋白10KD需要的注意点 1）可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系 2）也可以选择PSQ膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可 4、大分子量蛋白200KD需要的注意点 1）做200kd蛋白的WB时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心 2）转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析） 3）转膜液中甲醇含量可适当降低，推荐使用湿装转膜效率更高 二、制胶 1、凝胶质量 不连续SDS-PAGE胶对凝胶的要求较高，分离胶的PH值应在8.8左右，而浓缩胶的PH应在6.8左右，最好不要差过0.5个PH单位，因为这个PH条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要条件，也是保证能充分压缩样品的前提。因此，制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的PH值是否稳定是很重要的。 2、在用ddH2O压分离胶的时候为什么经常存在中间凸的现象 1）加水时不能对着胶冲，要沿着玻璃板缓慢流行 2）加水满后一定要保证上方水平面是平齐的 3）加胶要避免气泡，也要避免加胶太慢而提前凝固等现象 4）有其他人的经验是用异丙醇封胶封胶后左右晃一下 三、加样 1、点样 样品尽量不要与电泳液混合，这样能提高浓缩的效果，因为电泳液PH值为8.3，而样品为7.5，混合后会影响到样品的PH值，进而影响浓缩效果。因此，建议点样最好用长枪头，或者加样器，轻轻的将样品加到孔的底部。 2、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量 可以浓缩样品，也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。 四、电泳 1、电泳缓冲液 尽量用新鲜配制的。这样能保证PH值和离子强度的稳定 2、电压条件 我们经常用的浓缩时80V，分离时100V比较好，条带很平 3、转膜 膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。 五、封闭 1、封闭液的选用要求 1）常用封闭液为脱脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、无蛋白封闭液等 2) 封闭液浓度：封闭时一般用5%脱脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%无蛋白封闭液；配制二抗稀释液一般为1-5%脱脂牛奶，全部用PBS稀释 3) 封闭时间：室温1-2h、4度过夜或37度半小时 4) 封闭液pH：一般5%脱脂牛奶pH大约为6.0-6.5左右，而1%脱脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封闭液和稀释抗体的封闭液需要调pH至7.4；但是大多数抗体不调pH也可以做出来 5) 个人经验：5%脱脂牛奶封闭效果最佳，但有时也可能封闭过度，可以与BSA或无蛋白封闭液轮流更换 六、显色 1、抗体杂交与底物显色 一抗尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体，还有要注意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白；二抗一般都是效价很高的，只要室温下杂交1小时就可以了，适当延长也是可以的。另外，要选择灵敏度较高的化学反应底物。 2、WB中抗体的可以重复应用吗 答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。 3、免疫组化和WB可以用同一种抗体吗 答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。 第二部分 WB结果不理想可能的原因自查 从结果倒推操作过程中可能的问题，总的来说，WB结果不理想，可能的问题主要集中在以下几方面部分： 1、阴性结果的原因 1) 二抗条件过低：提高二抗浓度、延长二抗孵育时间或孵育温度 2) 一抗条件过低：提高一抗浓度、延长一抗孵育时间或孵育温度 3) 抗原过少：提高上样量 4) 抗体种属不兼容：一抗species reactivity中是否有需要检测样品的种属来源，一抗与二抗是否相匹配 5) 酶活性：二抗上标记的HRP或AP等酶活性降低，如抗体过期或反复化冻等 6) 封闭过度或封闭剂不兼容：降低封闭剂浓度、缩短封闭时间，或者更换封闭剂种类 7) 底物出现质量问题：可以通过点杂交试验排除底物和酶活性问题 8) 抗体稀释液pH：注意检测pH是否在6-8 9）样品不表达该目的蛋白 10）转膜不足或过头：优化转膜条件 11）其它：PVDF膜、保鲜膜质量问题等 12）抗体质量：换兴誉好的品牌抗体公司，如CST、Millipore、Abcam等 2、有杂带或背景的原因 1）目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小 2) 样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作 3）二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度 4）上样量过高：降低上样量，减少抗原含量 5）二抗条件过强：降低二抗浓度、缩短二抗孵育时间或改变温度等 6）一抗条件过强：降低一抗浓度、缩短一抗孵育时间和改变温度等 7）抗体质量不佳：如特异性不好，建议购买品牌公司的抗体 8）一抗稀释度不适宜，可以对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度 9）一抗孵育的温度偏高，建议4℃结合过夜 10）抗体浓度过高或洗涤不够，建议降低抗体浓度，增加洗涤次数和时间 11）膜清洗不全：增加清洗强度，如增加荡洗次数、延长清洗时间或加0.05-0.1%Tween 20等 11）ECL发光液本身因外源污染等原因存在很强的背景光，显影可以显示强的背景光，建议分装A和B液和更换发光液 12）缩短压片或曝光时间 13）膜没有完全均匀湿透，建议使用100% methanol浸透膜 14）电极不平衡或者加样位置偏斜，可以调整电极和加样 15）封闭不全：二抗与抗原有交叉反应，升高封闭剂浓度、延长封闭时间或更换不同的封闭剂，孵育时保证封闭液完全浸没转印膜 16）封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭； 17）封闭时间不够，一般情况下室温37度封闭1小时以上或者4度封闭过夜 18）抗体非特异性结合，可以降低抗体浓度，减少孵育时间 19）化学显色底物过多，建议按说明书加入适量的显色底物 3、为啥条带形状不好看 1）胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀 2）某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致 3) 缓冲液陈旧，成分改变,可以重配 4) 凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走 5）电泳时温度过高，可以降低电流或电压 6）样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀 4、蛋白条带位置（大小）不对 1）胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度 2）抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间 3）酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物 4）目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定 5）标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量 5、背景有黑色斑点或不均匀的白色斑点和暗背景上白色带 1）抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂 2）HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓度 3）HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体 4）抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床 6、为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白 1）细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞 2）抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题 3）可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长 4）细胞中的蛋白质被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性 7、我的目的带很弱，如何加强 1）可以加大抗原上样量，这是最主要的 2）也可以将一抗稀释比例降低 3）还可以延长曝光时间 以上内容主要根据网络信息收集，方便大家。当然如果有拿不准的，大家可以再继续找找相关的信息，祝大家实验顺利。 |
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