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学而不思则惘

新虫 (初入文坛)

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[交流] 关于无缝克隆的问题已有9人参与

嗯本人研一实验室小白一枚，因为是新建立的实验室，也木的师兄师姐带，所以来这里求助一下，顺便分享下我的经验
老师让我把一个13000的基因搞到手
我搞了八个月了，先是分成七段，拿提的cdna当模板p，这些都是小事，后来的拼接最开始用的圣羽的，挺得劲把2+3连起来了，再后来就死活做不出来，做了各种对照，觉得是试剂盒的问题，就换了诺唯赞的，后来就把2+3 4+5 6+7都连起来了，然后连2+3+4+5用的感受态还是自己实验室做的dh5，挑菌用第三段尾端设计了个引物，第四段开始设计了个引物，跑出来500bp的带，也挑出来了。接下来就是1+2+3连起来，然后用当时2+3+4+5连接时的同源臂，顺利的把1+2+3+4+5连起来了，测序也对了。
现在的问题是我用诺唯赞的试剂盒死活做不出来了，简单的4+5+6+7都连不起来，同样的手法，操作，感受态换成了买的也是不行，一个多月了，本来已经想好方法只要把4567连上，我就有能力把1234567连上，但是现在做不出来，谁最近做过无缝克隆，有推荐的做出来的试剂盒没？neb的就算了，也买了做不出来。我可以分享我目前的经验。
目前就是9200片段+5000pcdna3.1测序正确
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1楼2019-08-14 22:55:49

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soarshining

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专业: 抗肿瘤药物药理

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不知道你卡在哪一步？过了这么久解决没？先写一些自己的经验，也希望楼主能分享分享实验经验，我也对诺唯赞的无缝克隆头疼。

我用无缝克隆做缺失突变和插入突变，发现这个实验对引物要求相当高，因为需要两头互补，引物5`端会有几个碱基是和模板配不上的，一般我是两头各8个。这样还得保证引物除去这8个后的部分tm值要达到60℃以上，就不得不很长，遇到a/t比较多的有时候引物得有45个bp，这样的引物特别容易错配，有时候pcr都能卡你个把月才p出特异性好的条带。我还遇到过pcr 条带特异但是大小不对，最后发现除了需要的片段还多了很多，说明有一头的引物“特异”的发生错配。所以你每次连接理论都需要单克隆测序验证过然后继续往下连。虽然有所谓一次性好几个片段的，但是运气不好就会出问题，就是因为引物特异性没法保证。

另外我发现不同序列，对于这个15-21的要求也是不一样的，遇到过死活连不上然后把互补从16个变成20个然后连上的，也遇到过把互补区域挪移，变成上游留4个下游留12个然后就连起来的。真的挺玄学的。其实就是这个连接过程更深的东西没有研究透吧。

总的来说其实关键就是引物设计，不同长度互补区，断口在互补区域的位置，引物的特异性等等都有影响。

还有，说明书虽然说他家的pcrmix可以直接加入dpni消化模板，但还是建议做pcr回收再消化。有时候会得到模板假阳性。

此外，消化完了建议通过胶回收把目的片段纯化然后进行环化。pcr回收可能都不够，因为本身这个引物因为需要5`端有一段悬挂片段，容易出现非特异扩增，所以你进行重组环化的时候，用260/280测得浓度不准，跑胶用条带亮度去比的结果也不准，加进去的两个片段浓度就不是最适合的，这也影响连接的效率。做了胶回收，然后再重新跑胶通过条带亮度结合标曲去定量，这样子的结果才靠谱。有钱的话买那种定量用的荧光染料去曝光做标曲。

其他暂时没有了，转化连接产物尽量带上不加酶环化的阴性对照避免假阳性。

ps，无缝克隆，也有叫gibson assemble clone或者infusion clone。