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brightjoe

至尊木虫 (职业作家)

[交流] 两片段与载体连接

两片段(大小600、800左右)与载体(4800左右)连接,我的连接体系做了4个(15μL):片段A:1 片段B:1 载体: 1/1.5/2/3 T4连接酶:1 10*buffer:1.5 水补足至15μL,排除感受态的问题,没有长出克隆,请问什么原因呢?希望大家不吝赐教。附上纯化过的电泳图(右边两片段条带很亮,质粒较暗)

[ Last edited by amisking on 2009-5-31 at 19:03 ]
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
把载体多加点试一下.三片断连接酶切位点要设计好.
2楼2009-05-31 10:07:52
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weiwei1

木虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
照图片看,感觉是片段加的稍微多了些
3楼2009-05-31 10:26:54
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brightjoe

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
Originally posted by 克隆大虾 at 2009-5-31 10:07:
把载体多加点试一下.三片断连接酶切位点要设计好.

我载体加到4μL了,还是没有连上。
4楼2009-05-31 13:07:48
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ilaveu

木虫 (著名写手)

为什么不先连接2个片段
成功后再连第三个片段

三片段直接连效率很高吗?
5楼2009-05-31 14:41:38
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zhlq_mail

铜虫 (小有名气)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你调整一下片段和载体的相对浓度,连接时间长一点再试试!
6楼2009-05-31 15:00:19
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
载体的亮度不够说明你的载体回收的量太少,应该多加!试一试7:1或者 5:3的比例吧!
麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起,么有鱼丸粗面。。那,我要鱼丸么有鱼丸那,我要粗面…………么有粗面那,我要鱼丸粗面……………………
7楼2009-05-31 16:56:08
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