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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 跑qpcr其它目的基因的都出来了，就内参没有扩出来，该怎么办
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七叶漂漂

新虫 (著名写手)
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跑qpcr其它目的基因的都出来了，就内参没有扩出来，该怎么办
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9月份开学就是研二的了，实验一直做不出来，很心急。目前做的实验是用LPS(脂多糖)刺激小胶质细胞，分四个时间点用qpcr检测炎症因子的表达量。引物是一开始是自己通过pubned上面招的，也会从文献里面找，叫公司合成之前，自己都会在pubmed上的primer-blast验证一下引物的分子量，选的都是都是100-300bp的，而且是转录本少或者没有的那种的序列。我的老师还要我做qpcr之前还要用引物和cCDA扩增一下，用来跑琼脂凝胶，看看分子量和blast上的分子量能不能对上，对上了，再做qpcr。我看了很多qpcr方面的资料，也问了一些做qpcr的同学，他们觉得没有必要跑琼脂糖凝胶去验证分子量，最多就是blast一下。我感觉也不用，因为每次我跑出来分子量基本都对的上。我老师说一定要验证，不然很可能得到的是假阳性的结果，也确实，很多高分文献里的引物序列，我输进primer-blast去，会出现很多条分子量不一样的转录本，有的甚至两三千的分子量。然后我叫一位师兄用olig7帮我设计了一些引物序列，也在blast验证过，都符合引物设计的原则，下面是昨天用新引物跑qpcr的结果。用的仪器是罗氏的lightclcler480，程序是两步法。
第一张图片是内参和三个目的基因的ct值；第二张是内参的溶解曲线；第三张是三个目的基因的溶解曲线；第四张和第五张分别是是内参和三个目的基因的扩增曲线。
希望走过路过的师兄师姐大佬能帮我看一看，分析一下，小弟感谢(??ω`?)！

跑qpcr其它目的基因的都出来了，就内参没有扩出来，该怎么办


跑qpcr其它目的基因的都出来了，就内参没有扩出来，该怎么办-1


跑qpcr其它目的基因的都出来了，就内参没有扩出来，该怎么办-2


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1楼2019-08-08 11:42:24
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七叶漂漂

新虫 (著名写手)
引用回帖:
41楼: Originally posted by wudi0729 at 2019-08-08 12:56:38
我们以前做的还会把产物拿去测个序确认一下。小心驶得万年船。

嗯嗯，我昨天是把qpcr之后的产物拿来跑琼脂凝胶，紫外灯下看，内参的条带没有，三个目的基因的分子量和pubmed上面的能对上。

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47楼2019-08-08 13:15:45
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西门吹雪170

荣誉版主 (职业作家)
内参没问题吧？

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12楼2019-08-08 11:54:37
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hdchina20102楼
2019-08-08 11:42   回复  
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yuying04213楼
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。小角色。4楼
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Sunnie20155楼
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9602136楼
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回忆往昔7楼
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大表哥的年8楼
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走心ing9楼
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nadp16310楼
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西门吹雪17011楼
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xqyqwy13楼
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ulr93866814楼
2019-08-08 12:04   回复  
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