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七叶漂漂

新虫 (著名写手)


已领完
跑qpcr其它目的基因的都出来了,就内参没有扩出来,该怎么办
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9月份开学就是研二的了,实验一直做不出来,很心急。目前做的实验是用LPS(脂多糖)刺激小胶质细胞,分四个时间点用qpcr检测炎症因子的表达量。引物是一开始是自己通过pubned上面招的,也会从文献里面找,叫公司合成之前,自己都会在pubmed上的primer-blast验证一下引物的分子量,选的都是都是100-300bp的,而且是转录本少或者没有的那种的序列。我的老师还要我做qpcr之前还要用引物和cCDA扩增一下,用来跑琼脂凝胶,看看分子量和blast上的分子量能不能对上,对上了,再做qpcr。我看了很多qpcr方面的资料,也问了一些做qpcr的同学,他们觉得没有必要跑琼脂糖凝胶去验证分子量,最多就是blast一下。我感觉也不用,因为每次我跑出来分子量基本都对的上。我老师说一定要验证,不然很可能得到的是假阳性的结果,也确实,很多高分文献里的引物序列,我输进primer-blast去,会出现很多条分子量不一样的转录本,有的甚至两三千的分子量。然后我叫一位师兄用olig7帮我设计了一些引物序列,也在blast验证过,都符合引物设计的原则,下面是昨天用新引物跑qpcr的结果。用的仪器是罗氏的lightclcler480,程序是两步法。
第一张图片是内参和三个目的基因的ct值;第二张是内参的溶解曲线;第三张是三个目的基因的溶解曲线;第四张和第五张分别是是内参和三个目的基因的扩增曲线。
希望走过路过的师兄师姐大佬能帮我看一看,分析一下,小弟感谢(??ω`?)!

跑qpcr其它目的基因的都出来了,就内参没有扩出来,该怎么办


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困困的黄瓜

铁虫 (著名写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
找几个内参,先专门跑他们试试……合适了再用。没内参没意义

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24楼2019-08-08 12:22:16
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2019-08-08 12:21   回复  
七叶漂漂(金币+8): 谢谢参与
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