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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 蛋白表达
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yuanfeng

金虫 (小有名气)

[交流] 求助 蛋白表达

我要过表达大肠杆菌的一个基因，PCR后连接到载体上，转化DH5，然后测序，序列没问题。启动子用的T7，操作子lac，rbs序列和ATG都是用的载体上的，而且验证了没有出现移码突变。载体是pETDuet-1,IPTG诱导用的1mM,但是SDS-page电泳和原始菌株几乎一样，按照道理来说应该很多的。大家有没有遇到过类似的情况，介绍一下解决办法吧。
做样品用一下步骤：
1ml菌液离心后，用上样缓冲液200ul重悬，100度煮5min,离心后直接上样。
谢谢大家，自己和师兄师姐讨论很久，也没找到原因。谢谢大家。
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1楼 2009-05-29 22:32:21
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ilaveu

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
对这个问题很感兴趣
希望有高手能解答
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2楼2009-05-29 23:30:34
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your2007

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
呵呵，表达不表达确实很诡异的，我们这边即使是已表达出来的，有时候重复就不出来，可能和每个批次的原料，条件等多少有些关系，祝好运
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爱人者被爱，敬人者人敬
3楼2009-05-29 23:45:51
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wangshui

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0):鼓励一下！ 5-30 11:42
影响表达的因素太多，而且多数是我们尚不知道的，在实验过程中我们没有办法把这些因素一一控制，所以造成实验结果的不确定。没有办法，目前的现状就是这样。所以做好实验记录，可能把各种因素都考虑进去，提高实验的成功率。
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4楼2009-05-30 08:47:34
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lifeip

至尊木虫 (知名作家)
★
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 5-30 11:42
你换换培养基看，我们有一段时间也表达不出，后来发现是培养基的问题(我们当时买的是人家配好的培养基）。当然，也有些基因含稀有密码子，不能顺利表达。
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5楼2009-05-30 10:27:45
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xj22667

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
蛋白表达有时候是不稳定 但我觉得你上样缓冲液是不是加的太多了 （200u？）我们实验室只用50ul  上样缓冲液加多了 就会导致你最终点到胶上的pro很少 比较不出诱导出的目的蛋白l
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6楼2009-05-30 10:29:36
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tt1232028

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
上样缓冲液是有点多了，下次放少点
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7楼2009-05-30 11:09:16
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tt1232028

铁虫 (小有名气)
如果是培养问题，可以具体点解释下吗？
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8楼2009-05-30 11:11:39
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tangtl

木虫 (正式写手)

小木虫潜水者
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用超聲破碎細胞，因為有可能是包涵體形式存在。
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9楼2009-05-30 16:07:47
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DLLB

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以尝试换一下表达菌株，不表达可能是由于你的基因序列中含有稀有密码子
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10楼2009-05-31 18:00:32
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