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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 大家测序用pcr产物还是菌液
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
★ ★
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amisking(金币+1,VIP+0):说的有理！ 6-1 12:49
菌液和pcr产物我都用过了，要看你测序的目的了。如果是要全序列就用菌液或者质粒。这样可以看到引物部分的序列。一般通用测序引物在插入片段的前面一段。如果是要中间的某些片段，可以直接pcr产物，就比较简单了。
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31楼2009-06-01 12:27:48
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bbyu007

木虫 (正式写手)
菌液！
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我是笨笨鱼~~~
32楼2009-06-01 12:53:54
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以用来测序的产品有很多，第一个最简单的就是PCR扩增产物，第二是PCR纯化产物，第三是平板，第四是菌液，第五是菌液抽提的质粒等等。分别介绍一下，测序现在根据保证的长度我归纳为三个等级，400bp,600bp,800bp。再长的可能也有，但是常规测序不多见了，现在最多的是保证600bp的，国内的公司也基本上都能达到这个长度了。如果选择最简单的PCR扩增产物那如果做的是RT-PCR纯度很可能达不到测序的要求最好用产物二次PCR一下，但是这样纯度是够了，但是一定要保证几点，就是你扩增出来的必须只有一条目的片段，如果有杂带那么用PCR产物测序是无法测的。如果选用PCR纯化回收产物来测序比PCR扩增产物测序好了一些，浓度能保证而且切胶回收之后杂带也能出去了，除非产物目的片段一样的长度就有两条带你肉眼分不开那就没办法了，不过这种可能性比较小。我原来就比较喜欢用纯化回收产物测序，一般都没什么测不出来的问题，还比做克隆省了很多时间和操作。但是需要注意的是不管是PCR扩增产物还是纯化回收产物测序一般人都会选用单向测序，那么就是提交一条引物，如果你提交了两条引物但是不特别说明他们也只是单向给你测的。那么这样的单向测序就有些问题了，引物的部分我们知道扩增即使引物部分有那么一两个碱基不对也能扩增下去的，但是PCR的测序引物的部分是测不出来的，读出来的结果完全是你引物上的序列，所以引物和模板如果不一样那么测出来的就是错误的引物上的碱基了。再有就是长度问题了，保证的长度之内的结果可信，但是最后的十几二十个碱基也不可信。这里提供一个方法，比如我们的片段是400bp，我们选择一家保证长度是600bp的公司，那么我们提交两条引物然后选择双向测序，最终把两个方向的测序结果并在一起，第一条链起始部分看第二条链的结果，第二条连开始的部分开第一条链测序的结果，不知道我这么说是不是说明白了，但是超过了600bp的就没办法了，建议还是做克隆吧，送菌液结果，克隆产物的结果送去测序是不需要引物的，所以全长都是有保证准确性的，超过600bp的可以选择双向测序，再把结果拼接在一起，所有部分的结果都可信。至于送菌液还是送质粒这个我个人认为无所谓，要区分的是公司，有些公司你送菌液过去他们怎么涂板就是说不长菌，搞得你没办法，也不知道他们实验是咋做的，所以送质粒保险一些，那过去直接测了，如果不用担心测序公司的实验人员技术问题送菌液还是送质粒都可以。
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33楼2009-06-01 14:07:23
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ytetyio09

新虫 (正式写手)
we only use plasmid
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34楼2009-06-02 16:19:09
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yasmine

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个问题还讨论这么久，


回去看看测序原理吧
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想到达明天，今天就要起飞
35楼2009-06-02 16:53:01
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longjianer

木虫 (著名写手)

诚心做事,踏实做人
引用回帖:
Originally posted by longxiange520 at 2009-5-29 11:12:
基本上我每次都是用菌液测序的，让公司自己提前质粒。pCR产物肯定也可以啊！

我也是！
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在中国，大多数经常被人提起的学术牛人，我呸！。。。我只认识在文献中让我景仰的指路人！
36楼2009-06-02 16:57:09
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jason159951

新虫 (初入文坛)
还是选择菌液测序吧，PCR测序纯度都不高。
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夏天的海
37楼2009-06-22 00:03:50
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mourning

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
PCR产物有概率突变的，不能保证每个克隆都正确，这样都送菌液人家再提岂不麻烦？应该更贵吧
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38楼2009-06-22 00:11:05
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miller211

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我是用的PCR产物，让他们公司给纯化（只需5块钱）。。。
1.5kb的测个双向的 然后拼接就ok了
我感觉他们的成功率还是很高的
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39楼2009-06-22 00:57:21
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dyyyyy

铁杆木虫 (著名写手)
用菌液，侧的准，麻烦少，方便
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40楼2009-06-22 06:16:40
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