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[交流] 大家测序用pcr产物还是菌液

大家测序用pcr产物还是菌液，两者测序的结果有什么区别么？

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1楼2009-05-29 09:55:39

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amilie030312

金虫 (正式写手)

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注册: 2006-11-18
专业: 动物遗传学

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可以用来测序的产品有很多，第一个最简单的就是PCR扩增产物，第二是PCR纯化产物，第三是平板，第四是菌液，第五是菌液抽提的质粒等等。分别介绍一下，测序现在根据保证的长度我归纳为三个等级，400bp,600bp,800bp。再长的可能也有，但是常规测序不多见了，现在最多的是保证600bp的，国内的公司也基本上都能达到这个长度了。如果选择最简单的PCR扩增产物那如果做的是RT-PCR纯度很可能达不到测序的要求最好用产物二次PCR一下，但是这样纯度是够了，但是一定要保证几点，就是你扩增出来的必须只有一条目的片段，如果有杂带那么用PCR产物测序是无法测的。如果选用PCR纯化回收产物来测序比PCR扩增产物测序好了一些，浓度能保证而且切胶回收之后杂带也能出去了，除非产物目的片段一样的长度就有两条带你肉眼分不开那就没办法了，不过这种可能性比较小。我原来就比较喜欢用纯化回收产物测序，一般都没什么测不出来的问题，还比做克隆省了很多时间和操作。但是需要注意的是不管是PCR扩增产物还是纯化回收产物测序一般人都会选用单向测序，那么就是提交一条引物，如果你提交了两条引物但是不特别说明他们也只是单向给你测的。那么这样的单向测序就有些问题了，引物的部分我们知道扩增即使引物部分有那么一两个碱基不对也能扩增下去的，但是PCR的测序引物的部分是测不出来的，读出来的结果完全是你引物上的序列，所以引物和模板如果不一样那么测出来的就是错误的引物上的碱基了。再有就是长度问题了，保证的长度之内的结果可信，但是最后的十几二十个碱基也不可信。这里提供一个方法，比如我们的片段是400bp，我们选择一家保证长度是600bp的公司，那么我们提交两条引物然后选择双向测序，最终把两个方向的测序结果并在一起，第一条链起始部分看第二条链的结果，第二条连开始的部分开第一条链测序的结果，不知道我这么说是不是说明白了，但是超过了600bp的就没办法了，建议还是做克隆吧，送菌液结果，克隆产物的结果送去测序是不需要引物的，所以全长都是有保证准确性的，超过600bp的可以选择双向测序，再把结果拼接在一起，所有部分的结果都可信。至于送菌液还是送质粒这个我个人认为无所谓，要区分的是公司，有些公司你送菌液过去他们怎么涂板就是说不长菌，搞得你没办法，也不知道他们实验是咋做的，所以送质粒保险一些，那过去直接测了，如果不用担心测序公司的实验人员技术问题送菌液还是送质粒都可以。