24小时热门版块排行榜

返回列表

swatow_yu

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 3
帖子: 11
在线: 5.3小时
虫号: 9324602
注册: 2018-07-04
专业: 中药内分泌及代谢药理

[求助] 关于qPCR绝对定量质粒标曲模板加量的问题已有2人参与

各位师兄师姐，有个关于qPCR绝对定量的问题想请教。
这是一个用绝对定量方法，构建质粒，求得标曲，代入待测样本Ct值求拷贝量的实验的菜鸟实验。
然后本菜狗被一个问题绕晕了。希望大佬们解答。
1，质粒nanodrop测得浓度，公式（6.02×10^9×浓度×10^-9）/（质粒bp+连接片段bp）×660 =拷贝数（copies/μL）。
将上面质粒浓度稀释到10^9copies/μL，因为单位是copies/μL，就开始有点绕不明白

2，体系20μL如下：
permix（10μL）、
F引物（0.8μL）、
R引物（0.8μL）、
ROX校正荧光（0.4μL）、
水（6μL）、
待测模板/标曲质粒（2μL）。

3，问题是：
整个标曲体系中加了 2μL 的 10^9（copies/μL） ~10^1（copies/μL）的标曲质粒DNA，那么此刻体系含有的拷贝量就是 2μL x 10^9 copies，那么这一个梯度的标曲体系，它的拷贝量是算作 10^9 还是 2x10^9 ？？？。。
在画标曲的时候，这一个梯度的坐标应该是 x2μL 还是不 x2μL ，不 x2 的话待测模板的浓度是不是也不 x2μL。

4，因为看了别人的实验记录，是体系加2μL的标曲质粒DNA或者待测模板，但是标曲的拷贝数坐标并没有 x2，

回复此楼