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如何消除质粒上的酶切位点
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例如 Hind III 设想用Hind III切开，再把突出的粘性末端削掉，质粒回连，就消除掉了这个位点 查了S1核酸酶的说明书，不理解下面的步骤使用例： DNA单链部分的特异性分解 1. 在微量离心管中配制下列反应液。 DNA 1 μg 10×S1 Buffer 2 μl S1 Nuclease 10 U H2O up to 20 μl 2. 23℃反应15分钟。 3. 用20 μl的20 mM EDTA停止反应。 4. 加入40 μl（等量）的苯酚/氯仿/异戊醇（25 ：24 ：1），充分混匀。 5. 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。 6. 加入40 μl（等量）的氯仿/异戊醇（24 ：1），充分混匀。 7. 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。 8. 加入4 μl（1/10量）的3 M NaOAC（pH5.2）。 9. 加入100 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。 10. 离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。 11. 溶解于适量的TE Buffer后，用Klenow Fragment或T4 DNA Polymerase把DNA片段修复成平滑末端。 第二部分中的步骤是不是可以用酒精沉淀的方法代替？ 既然S1核酸酶可以消除掉单链，为什么后面还要用T4DNA聚合酶修复？ 有没有更好的酶或者方法？ |
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2楼2009-05-27 10:40:57
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