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鲁班揍墨子

新虫 (初入文坛)

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[求助] 克雷伯氏菌基因敲除一直失败已有2人参与

克雷伯氏菌敲除实验最近一直失败

决明子_c5iz
从六月十五号到七月初，半个月的时间。用crispcas9敲除克雷伯氏菌的基因一直失败。

敲除步骤如下：

1.往lb培养基中加入kana抗生素，同时加入含有cas9质粒的克雷伯氏菌过夜培养

2.第二天转接二级种子，od等于0. 2时加入l型阿拉伯糖诱导终浓度10mmol 培养到od等于0.4 ~0.6之间。放冰上半小时

3.四度离心，收集菌体。5000rpm 5min。用10%甘油洗三次，离心三次。

4.加入10%甘油1ml，吹打混匀，分装到1.5ml离心管。加入1000ng的donor片段和120ng的sgrna质粒。2500v 5ms电转，电转后立即加入lb培养基复苏。30度后培养1h离心收集涂布kana和spe双抗性板

5.第三天查看平板菌落生长情况挑选单菌落进行pcr验证

当前存在问题：

4.收集菌体涂布平板查看平板菌落生长情况时发现一直糊板未发现单菌落

已经更换阿拉伯糖抗生素也重新配置 sgrna已经更换四对实在想不出原因

@天使托发自小木虫Android客户端

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