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克雷伯氏菌基因敲除一直失败 已有2人参与
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克雷伯氏菌敲除实验 最近一直失败 决明子_c5iz 从六月十五号到七月初，半个月的时间。用crispcas9敲除克雷伯氏菌的基因一直失败。 敲除步骤如下： 1.往lb培养基中加入kana抗生素，同时加入含有cas9质粒的克雷伯氏菌过夜培养 2.第二天转接二级种子，od等于0. 2时加入l型阿拉伯糖诱导 终浓度10mmol 培养到od等于0.4 ~0.6之间。放冰上半小时 3.四度离心，收集菌体。5000rpm 5min。用10%甘油洗三次，离心三次。 4.加入10%甘油1ml，吹打混匀，分装到1.5ml离心管。加入1000ng的donor片段和120ng的sgrna质粒。2500v 5ms电转，电转后立即加入lb培养基复苏。30度后培养1h离心收集涂布kana和spe双抗性板 5.第三天查看平板菌落生长情况 挑选单菌落进行pcr验证 当前存在问题： 4.收集菌体涂布平板 查看平板菌落生长情况时 发现一直糊板 未发现单菌落 已经更换阿拉伯糖 抗生素也重新配置 sgrna已经更换四对 实在想不出原因 @天使托 发自小木虫Android客户端 |
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