24小时热门版块排行榜    

查看: 313  |  回复: 8
当前主题已经存档。

buffoon_1985

银虫 (小有名气)

[交流] 连接检验问题

我用PCR片段去连接载体质粒
挑取转化子后做菌落PCR,有明显目的条带出现
但是提质粒后,连接片段却不能酶切出来,这是为什么捏
很费解啊,各位帮个忙解释下~
回复此楼

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

连接片段多长?所谓的酶切不出来是什么意思?
2楼2009-05-24 11:09:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

buffoon_1985

银虫 (小有名气)

连接片段500bp
酶切不出来500bp的连接条带
BamHI酶切的,效率我觉得应该没问题

[ Last edited by buffoon_1985 on 2009-5-24 at 11:13 ]
3楼2009-05-24 11:12:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

有可能是上样量小看不见500bp的带
你用单酶切的方法比较空质粒和菌落PCR阳性的质粒比较
当然前提是质粒本身也不会太大
一般来说,我做到菌落PCR阳性就停了,不继续做了
直接送测序
4楼2009-05-24 11:19:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

buffoon_1985

银虫 (小有名气)

嘿嘿
我的质粒就是很大7k
上样5微升应该也没问题哈
测序至今没做过
5楼2009-05-24 14:35:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

anik

银虫 (正式写手)

提取的质粒的质量如何?量太少是切不出来亮条带的
6楼2009-05-24 14:39:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wfmgood

银虫 (小有名气)

建议确定以下几点:
提取质粒的纯度与浓度?
酶切体系:酶是否失活,酶切时间等等?
7楼2009-05-24 15:19:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

质粒与目的片段大小太悬殊的话,切下的目的片段亮度会不够,可能看不见。
pcr能p出来应该就没问题了。
我有个构建的质粒也是的,pcr没问题。
双酶切总是只能切开,和两种酶各自单酶切一样的效果。
单酶切后回收,再用另外一种酶酶切仍然不行,我崩溃不管了。
Thank-you,so-blue.
8楼2009-05-24 18:26:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

buffoon_1985

银虫 (小有名气)

提的质粒还是很亮的哈~
susizheng也是这样哈?很奇妙的。。。
另外谢谢大家的关注啊~
9楼2009-05-25 15:00:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 buffoon_1985 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
信息提示
请填处理意见