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buffoon_1985

银虫 (小有名气)

[交流] 连接检验问题

我用PCR片段去连接载体质粒
挑取转化子后做菌落PCR,有明显目的条带出现
但是提质粒后,连接片段却不能酶切出来,这是为什么捏
很费解啊,各位帮个忙解释下~
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

连接片段多长?所谓的酶切不出来是什么意思?
2楼2009-05-24 11:09:29
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buffoon_1985

银虫 (小有名气)

连接片段500bp
酶切不出来500bp的连接条带
BamHI酶切的,效率我觉得应该没问题

[ Last edited by buffoon_1985 on 2009-5-24 at 11:13 ]
3楼2009-05-24 11:12:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

有可能是上样量小看不见500bp的带
你用单酶切的方法比较空质粒和菌落PCR阳性的质粒比较
当然前提是质粒本身也不会太大
一般来说,我做到菌落PCR阳性就停了,不继续做了
直接送测序
4楼2009-05-24 11:19:25
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buffoon_1985

银虫 (小有名气)

嘿嘿
我的质粒就是很大7k
上样5微升应该也没问题哈
测序至今没做过
5楼2009-05-24 14:35:40
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anik

银虫 (正式写手)

提取的质粒的质量如何?量太少是切不出来亮条带的
6楼2009-05-24 14:39:27
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wfmgood

银虫 (小有名气)

建议确定以下几点:
提取质粒的纯度与浓度?
酶切体系:酶是否失活,酶切时间等等?
7楼2009-05-24 15:19:21
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

质粒与目的片段大小太悬殊的话,切下的目的片段亮度会不够,可能看不见。
pcr能p出来应该就没问题了。
我有个构建的质粒也是的,pcr没问题。
双酶切总是只能切开,和两种酶各自单酶切一样的效果。
单酶切后回收,再用另外一种酶酶切仍然不行,我崩溃不管了。
Thank-you,so-blue.
8楼2009-05-24 18:26:14
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buffoon_1985

银虫 (小有名气)

提的质粒还是很亮的哈~
susizheng也是这样哈?很奇妙的。。。
另外谢谢大家的关注啊~
9楼2009-05-25 15:00:40
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