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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 连接检验问题
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buffoon_1985

银虫 (小有名气)

[交流] 连接检验问题

我用PCR片段去连接载体质粒
挑取转化子后做菌落PCR，有明显目的条带出现
但是提质粒后，连接片段却不能酶切出来，这是为什么捏？
很费解啊，各位帮个忙解释下~
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1楼 2009-05-24 10:59:57
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
连接片段多长？所谓的酶切不出来是什么意思？
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2楼2009-05-24 11:09:29
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buffoon_1985

银虫 (小有名气)
连接片段500bp
酶切不出来500bp的连接条带
BamHI酶切的，效率我觉得应该没问题

[ Last edited by buffoon_1985 on 2009-5-24 at 11:13 ]
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3楼2009-05-24 11:12:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
有可能是上样量小看不见500bp的带
你用单酶切的方法比较空质粒和菌落PCR阳性的质粒比较
当然前提是质粒本身也不会太大
一般来说，我做到菌落PCR阳性就停了，不继续做了
直接送测序
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4楼2009-05-24 11:19:25
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buffoon_1985

银虫 (小有名气)
嘿嘿
我的质粒就是很大7k
上样5微升应该也没问题哈
测序至今没做过
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5楼2009-05-24 14:35:40
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anik

银虫 (正式写手)
提取的质粒的质量如何？量太少是切不出来亮条带的
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6楼2009-05-24 14:39:27
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wfmgood

银虫 (小有名气)
建议确定以下几点：
提取质粒的纯度与浓度？
酶切体系：酶是否失活，酶切时间等等？
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7楼2009-05-24 15:19:21
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
质粒与目的片段大小太悬殊的话，切下的目的片段亮度会不够，可能看不见。
pcr能p出来应该就没问题了。
我有个构建的质粒也是的，pcr没问题。
双酶切总是只能切开，和两种酶各自单酶切一样的效果。
单酶切后回收，再用另外一种酶酶切仍然不行，我崩溃不管了。
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Thank-you，so-blue.
8楼2009-05-24 18:26:14
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buffoon_1985

银虫 (小有名气)
提的质粒还是很亮的哈~
susizheng也是这样哈？很奇妙的。。。
另外谢谢大家的关注啊~
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9楼2009-05-25 15:00:40
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