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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » siRNA细胞转染实验步骤
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人间芳菲

禁虫 (正式写手)
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1楼 2019-06-10 16:05:39
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Explor

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
以RFect小核酸转染试剂为例
适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。
A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔500 μl培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50%。
B. siRNA-RFect混合物准备：
1.6pmol siRNA 用50μl无血清培养基稀释。
2.2μl RFect用50μl无血清培养基稀释。轻轻混匀，室温孵育5min。注意：确保在25 min内执行第三步操作，不要过于延迟。
3.孵育5min后，将siRNA 稀释液与RFect 稀释液混合（总体积100μl）。轻轻混匀，室温孵育20 min。
C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：
1.将100μl混合物加入培养孔内，培养孔内含有0.5ml培养的细胞。轻轻晃动培养板，混匀。
2.37°C培养18-72h，检测基因抑制效果。如果需要，细胞培养4-6h时可以更换培养基，但不是必须。孵育时间的长短，取决于细胞类型、
所干扰基因本身及分析方法。可设置不同的孵育时间进行实验以确定最佳孵育时间。
转染实验要点：
转染过程不可添加抗生素，否则会导致细胞死亡；
首次实验siRNA的用量设置在终浓度10nM、30nM、50nM、100 nM进行摸索 ，后续实验根据实验结果修改。
转染实验优化: 为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。例如：24孔培养板，调整 siRNA与RFect试剂的用量。
siRNA 用量在0.6-30 pmol(final concentration 1- 50 nM)之间调整，RFect试剂用量在1.0 - 3.0μl之间调整。客户可按照习惯用量进行预实验，如实验结果不理想，可适当调整并摸索转染试剂用量。
更多内容可以到www.biodai.com.cn咨询
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2楼2019-10-28 08:44:49
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你是路人甲

铜虫 (小有名气)
我们实验室用RFect sRNA Transfection Reagent，细胞密度在45%左右 ,设置siRNA终浓度10nM,30nM,50nM,100nM四个梯度，每个梯度最好做2个复孔，一般做转染前一天铺板，用来稀释siRNA和稀释转染试剂的培养基必须是无血清培养基，因为血清的存在会干扰siRNA与转染试剂的混合，并且影响转染效率。转染后48h收细胞做qPCR基因水平检测或者转染后72h收细胞提蛋白做western Blotting蛋白水平检测，一般情况设置一个空白组，一个对照组
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3楼2019-11-13 11:50:22
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