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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双酶切问题
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沧海蝴蝶

[交流] 双酶切问题

PCR产物（1kb）与PMD18-T连接后转化，挑白班提取质粒，质粒大概2.5kb。用XhoⅠ、NdeⅠ双酶切，过夜，怎么切不开啊。各位帮我分析分析什么原因，谢谢了。
50μl酶切体系：
XhoⅠ                  1.5μl
NdeⅠ                  1.5μl
重组质粒              1μl
10×H Buffer          5μl
灭菌ddH2O           补足50μl
37℃过夜
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1楼 2009-05-22 11:52:23
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
H buffer？takara的酶？
切不动那是正常的~~他们的酶产品只能用垃圾来形容
推荐NEB或者Fermentas
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2楼2009-05-22 12:34:51
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695

木虫 (职业作家)
up for the upstairs!
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3楼2009-05-22 18:07:58
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anik

银虫 (正式写手)
支持楼上的。。。
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4楼2009-05-22 18:47:27
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沧海蝴蝶

谢谢，还请问一下，PCR产物（1kb）与PMD18-T（2.7kb）连接后，质粒2.5kb，正常吗？
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5楼2009-05-22 21:38:33
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
你的意思是连接后质粒变小了
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6楼2009-05-22 21:40:55
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x8q4h11

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 沧海蝴蝶 at 2009-5-22 21:38:
谢谢，还请问一下，PCR产物（1kb）与PMD18-T（2.7kb）连接后，质粒2.5kb，正常吗？

不正常。应该是没连上，你挑的菌落是假阳性的；最好做个菌液PCR鉴定阳性菌落。takara的能切开的，我们实验室都用的，挺好用的，37度切4-6个小时就能切开；不过50微升体系的话应该用2.5微升NdeI和2.5微升XhoI。
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7楼2009-05-22 21:53:20
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
引用回帖:
Originally posted by 沧海蝴蝶 at 2009-5-22 21:38:
谢谢，还请问一下，PCR产物（1kb）与PMD18-T（2.7kb）连接后，质粒2.5kb，正常吗？

我觉得环状跑到2.5Kb还是正常的，我T连2kb不酶切可以跑到3kb（当然已经确定是重组好的）。
酶用量感觉应该没问题。至于你的质粒酶切用量只有1uL，质粒不会提得那么好吧，50uL全点亮度怎么样。
楼上正解，做下菌液pcr吧。
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Thank-you，so-blue.
8楼2009-05-22 22:34:17
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juke9910

铜虫 (初入文坛)
我的经验是，PCR产物要切5hr左右，最好过夜， 质粒3hr左右足以。重组质粒一般切1h能切开。。
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9楼2009-05-22 22:40:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
用NEB或Fermentas的快速内切酶，5min完成
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10楼2009-05-22 23:33:20
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