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沧海蝴蝶

[交流] 双酶切问题

PCR产物(1kb)与PMD18-T连接后转化,挑白班提取质粒,质粒大概2.5kb。用XhoⅠ、NdeⅠ双酶切,过夜,怎么切不开啊。各位帮我分析分析什么原因,谢谢了。
50μl酶切体系:
XhoⅠ                  1.5μl
NdeⅠ                  1.5μl
重组质粒              1μl
10×H Buffer          5μl
灭菌ddH2O           补足50μl
37℃过夜
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

H buffer?takara的酶?
切不动那是正常的~~他们的酶产品只能用垃圾来形容
推荐NEB或者Fermentas
2楼2009-05-22 12:34:51
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695

木虫 (职业作家)

up for the upstairs!
3楼2009-05-22 18:07:58
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anik

银虫 (正式写手)

支持楼上的。。。
4楼2009-05-22 18:47:27
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沧海蝴蝶

谢谢,还请问一下,PCR产物(1kb)与PMD18-T(2.7kb)连接后,质粒2.5kb,正常吗?
5楼2009-05-22 21:38:33
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

你的意思是连接后质粒变小了
6楼2009-05-22 21:40:55
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x8q4h11

木虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 沧海蝴蝶 at 2009-5-22 21:38:
谢谢,还请问一下,PCR产物(1kb)与PMD18-T(2.7kb)连接后,质粒2.5kb,正常吗?

不正常。应该是没连上,你挑的菌落是假阳性的;最好做个菌液PCR鉴定阳性菌落。takara的能切开的,我们实验室都用的,挺好用的,37度切4-6个小时就能切开;不过50微升体系的话应该用2.5微升NdeI和2.5微升XhoI。
7楼2009-05-22 21:53:20
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

引用回帖:
Originally posted by 沧海蝴蝶 at 2009-5-22 21:38:
谢谢,还请问一下,PCR产物(1kb)与PMD18-T(2.7kb)连接后,质粒2.5kb,正常吗?

我觉得环状跑到2.5Kb还是正常的,我T连2kb不酶切可以跑到3kb(当然已经确定是重组好的)。
酶用量感觉应该没问题。至于你的质粒酶切用量只有1uL,质粒不会提得那么好吧,50uL全点亮度怎么样。
楼上正解,做下菌液pcr吧。
Thank-you,so-blue.
8楼2009-05-22 22:34:17
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juke9910

铜虫 (初入文坛)

我的经验是,PCR产物要切5hr左右,最好过夜, 质粒3hr左右足以。重组质粒一般切1h能切开。。
9楼2009-05-22 22:40:06
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

用NEB或Fermentas的快速内切酶,5min完成
10楼2009-05-22 23:33:20
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