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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 一直扩不出启动子全长，只能扩一部分
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饿了就哭

新虫 (初入文坛)

[求助] 一直扩不出启动子全长，只能扩一部分 已有3人参与

扩增四个植物物种的启动子，用参考序列设计的引物（可能特异性不是特别好），只能扩增出后半部分，后面根据前半部分重新设计引物，扩增出来了一个物种完整的前半部分，拼接之后，重新设计全长引物，扩增不出全长，不清楚是什么原因？？另外，最近用原来扩出条带的引物重新扩增，跑胶后空空如也，都扩不出来了，pcr的条件都未改变，那可能是什么原因呢？会不会是因为DNA反复冻融，被降解，影响了pcr效果么？另外扩启动子全长，降落pcr和双温pcr效果会不会更好？？

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2019-05-25 08:51:06
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Kooony

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiaomu321 at 2019-05-30 10:53:07
我也遇到过，估计是引物设计不好，你可以在两个片段两端都加上酶切位点，要用的时候酶切酶连就行了，启动子多6个碱基一般问题不大

正在扩启动子，也是遇到了这样的问题，一共四个启动子，两个可能p出了目的条带，正打算送测序，另两个怎么都p不出。。。
不知道是启动子的引物都比较难找吗，我的这四个找的很艰辛，不是很会选，最后选了一对，也加了酶切位点
有个师兄给我说，他都是在要扩增的起始和终止直接设计引物，或者稍微外扩一些，先扩出来再说
想请教一下大佬们，关于启动子扩增的引物设计经验之谈，以及关于启动子扩增遇到的其他问题和解决的办法
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7楼2020-07-02 18:01:52
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王希望

铁杆木虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-27 22:27:28
重头开始做，最节约时间。建议不找原因。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2019-05-27 16:30:01
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xiaomu321

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也遇到过，估计是引物设计不好，你可以在两个片段两端都加上酶切位点，要用的时候酶切酶连就行了，启动子多6个碱基一般问题不大
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3楼2019-05-30 10:53:07
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眺望爱

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

要确定是不是降解了可以点检测胶看一下。
另外扩增不出可能性：本身扩增片段有难度，高GC或者低GC，高重复，都是可能的。
                             引物降解了，或者引物设计有问题
                             模板浓度低或者就不是正确的克隆
                             聚合酶失活了
赞一下(1人) 回复此楼
目标：生物的星辰大海！！！！
4楼2019-05-30 13:15:29
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