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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 一直扩不出启动子全长，只能扩一部分
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饿了就哭

新虫 (初入文坛)

[求助] 一直扩不出启动子全长，只能扩一部分 已有3人参与

扩增四个植物物种的启动子，用参考序列设计的引物（可能特异性不是特别好），只能扩增出后半部分，后面根据前半部分重新设计引物，扩增出来了一个物种完整的前半部分，拼接之后，重新设计全长引物，扩增不出全长，不清楚是什么原因？？另外，最近用原来扩出条带的引物重新扩增，跑胶后空空如也，都扩不出来了，pcr的条件都未改变，那可能是什么原因呢？会不会是因为DNA反复冻融，被降解，影响了pcr效果么？另外扩启动子全长，降落pcr和双温pcr效果会不会更好？？

@biostar2009 发自小木虫IOS客户端
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1楼 2019-05-25 08:51:06
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眺望爱

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

要确定是不是降解了可以点检测胶看一下。
另外扩增不出可能性：本身扩增片段有难度，高GC或者低GC，高重复，都是可能的。
                             引物降解了，或者引物设计有问题
                             模板浓度低或者就不是正确的克隆
                             聚合酶失活了
赞一下(1人) 回复此楼
目标：生物的星辰大海！！！！
4楼2019-05-30 13:15:29
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王希望

铁杆木虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-05-27 22:27:28
重头开始做，最节约时间。建议不找原因。
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2楼2019-05-27 16:30:01
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xiaomu321

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我也遇到过，估计是引物设计不好，你可以在两个片段两端都加上酶切位点，要用的时候酶切酶连就行了，启动子多6个碱基一般问题不大
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3楼2019-05-30 10:53:07
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桐城花开

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

三个选择方案：
1、多设计几对引物，多提几个基因组，然后重新P。如果还是P不出，建议换高效率高保真酶。如果还是搞不出来，参考2。
2、如果能够p出目标大小产物，但太弱无法回收做酶切连接等，可以把回收产物作为模板（模板不建议多加，如果回收是30ul，那么模板2~5ul，模板加太多会p不出来），重新PCR。如果还是搞不出来，参考3。
3、如果实在难P，即光板一块。针对难P的全长启动子，如果太长，可以设计两轮PCR，第一轮：即第一次P出一半部分，第二次P出剩下一半部分（这两部分需要有重复交叉），然后回收产物混合；第二轮：用第一轮PCR正向引物F和第二轮反向引物R，模板为回收产物（如果太浓建议稀释10倍，50ul体系加2ul；如果很弱不稀释。）
不知道你明白没有，祝你好运。
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5楼2019-07-12 11:12:15
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