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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何准确的筛选重组子
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sgba0307

铁虫 (小有名气)

[交流] 如何准确的筛选重组子

我是在pet32a质粒中插入一个92bp的目的基因，连接之后涂平板挑取阳性克隆单菌落培养后提取质粒，用这些质粒做模板用目的基因引物来扩增，并用了一个空白的质粒来扩增做对照，跑电泳后显示所有的质粒都扩增出来了一条相同大小的片段，包括那个空白的质粒，现在我该怎么样来准确的筛选到底哪些是我所需要的已经连接上的重组子？谢谢帮忙解答，不胜感激！
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1楼 2009-05-21 15:36:11
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dianaofyezi

金虫 (正式写手)
★ ★
sxdxrhyy(金币+2,VIP+0):欢迎常来!谢谢 5-21 20:17
首先，保证你PCR过程中没有其他物质的污染导致了结果的无法判定。然后由于你连接的外源片断比较小，所以直接电泳肯定是分不开的。我建议用两种或者两种以上的检测手段进行检测，比如说你做的PCR，或者选择不同的内切酶进行比较，只是用酶进行检测的时候最好是双酶切，这样能在电泳的时候显示出差别。
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52187644
2楼2009-05-21 19:30:32
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)
★
sxdxrhyy(金币+1,VIP+0):欢迎常来参与讨论！ 5-21 20:17
直接测序，现在测序真的是很便宜了
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3楼2009-05-21 19:33:33
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wordsworth3180

木虫 (正式写手)
插入片断很小，pcr容易出现假阳性
建议可以挑一个能扩出比较粗亮条带的重组菌去测序
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4楼2009-05-21 21:15:07
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lifefamily

PCR鉴定是第一步，第二步，也就是最关键的是表达鉴定！
另外，PCR鉴定时没必要提取质粒来做模板，直接取1微升菌液为模板来PCR就是。挑选PCR鉴定为阳性的克隆，摇菌做表达鉴定。
表达鉴定也呈阳性的，再送菌液去测序（2、30块钱一个样）。
这样下来就能确保你的克隆构建正确。
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5楼2009-05-22 08:45:17
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bbyu007

木虫 (正式写手)
蓝白筛选+菌液PCR+酶切验证+测序！
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我是笨笨鱼~~~
6楼2009-05-22 08:56:58
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