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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建载体
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星星不太萌

新虫 (小有名气)

[求助] 构建载体 已有1人参与

载体和目的片段连接好后，挑阳性克隆菌落，PCR验证有目的条带，酶切验证却切不下来，送PCR产物，测序结果显示目的序列在，就是酶切不下来，请教各位大神，这是什么原因呢？

@wizardfan @biostar2009 @youlinglyw @飞约疯人院 @飞约疯人院 发自小木虫Android客户端
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1楼 2019-03-02 16:35:45
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Esther_Young

铜虫 (小有名气)
★ ★
星星不太萌(渊博震天代发): 金币+2, 鼓励积极回帖 2019-03-03 16:34:03
1. 内切酶或者buffer的问题（不过你目的基因和载体都切好了证明没问题）；2.质粒提取浓度低或者质量不好（摇菌8小时以上再提质粒，可以适当加大菌液使用量）；3.直接送质粒去测序 进行验证

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2楼2019-03-03 02:01:59
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星星不太萌

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Esther_Young at 2019-03-03 02:01:59
1. 内切酶或者buffer的问题（不过你目的基因和载体都切好了证明没问题）；2.质粒提取浓度低或者质量不好（摇菌8小时以上再提质粒，可以适当加大菌液使用量）；3.直接送质粒去测序 进行验证
...

一般质粒提取的浓度8ml菌液可以提300多ng/ul，还是直接送质粒测序比较可靠，菌液PCR和提质粒PCR跑出来的条带不一样。

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3楼2019-03-03 09:27:44
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965688871

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你用载体通用引物进行菌检。然后送菌抽质粒测序。

如果测序正确还切不开，再找buffer和内切酶的问题。
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4楼2019-03-04 08:16:26
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