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分子克隆
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最近一直在做分子克隆，线性化载体连接转化，根据neb推荐的各种摩尔比做的连接体系，单菌落是长出来了，可是酶切验证一直是自连，用的是psuper载体，一个月了还没有构建出来，求各位大神指教 发自小木虫Android客户端 |
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snoopytbw: 金币+3, 鼓励 2019-03-01 10:52:56
snoopytbw: 金币+3, 鼓励 2019-03-01 10:52:56
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首先确保酶切位点对，并且空载体酶切位点未突变(可以空载体测序验证，当然即使测序对了也不一定能用，有可能酶切位点被甲基化等表观遗传学修饰，导致切不开)，适当降低载体浓度，确保大多数载体都能以双酶切的形式切开，并适当延长酶切时间。具体的可以参考文献Why Johnny can't clone: Common pitfalls and not so common solutions.当然可能看了逐步验证还是连不上，挑不到正确的克隆。推荐个人常用方法直接根据载体双酶切位点设计两个引物，直接P质粒，然后双酶加Dpn1三酶酶切，目的片段双酶切，然后按1:3-10酶连即可。载体模板至少要单酶切(防止P出来的载体还是环状的，比如我用的Phusion酶，如果不切就是) 发自小木虫Android客户端 |
2楼2019-03-01 09:57:58
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3楼2019-03-01 09:59:34
4楼2019-03-01 22:39:53
