| 查看: 731 | 回复: 3 | |||
[求助]
分子克隆
|
|
最近一直在做分子克隆，线性化载体连接转化，根据neb推荐的各种摩尔比做的连接体系，单菌落是长出来了，可是酶切验证一直是自连，用的是psuper载体，一个月了还没有构建出来，求各位大神指教 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
327求调剂
已经有11人回复
-
调剂
已经有8人回复
-
梁成伟老师课题组欢迎你的加入
已经有7人回复
-
伙伴们，祝我生日快乐吧
已经有24人回复
-
中科院材料273求调剂
已经有3人回复
-
材料工程专硕274一志愿211求调剂
已经有5人回复
-
本人考085602 化学工程 专硕
已经有8人回复
-
求老师收留调剂
已经有5人回复
-
机械专硕调剂
已经有3人回复
-
东华理工大学化材专业26届硕士博士申请
已经有6人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
多细胞11
新虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 4815.7
- 红花: 1
- 帖子: 425
- 在线: 65.1小时
- 虫号: 3822516
- 注册: 2015-04-20
- 专业: 微生物遗传育种学
★ ★ ★
snoopytbw: 金币+3, 鼓励 2019-03-01 10:52:56
snoopytbw: 金币+3, 鼓励 2019-03-01 10:52:56
|
首先确保酶切位点对，并且空载体酶切位点未突变(可以空载体测序验证，当然即使测序对了也不一定能用，有可能酶切位点被甲基化等表观遗传学修饰，导致切不开)，适当降低载体浓度，确保大多数载体都能以双酶切的形式切开，并适当延长酶切时间。具体的可以参考文献Why Johnny can't clone: Common pitfalls and not so common solutions.当然可能看了逐步验证还是连不上，挑不到正确的克隆。推荐个人常用方法直接根据载体双酶切位点设计两个引物，直接P质粒，然后双酶加Dpn1三酶酶切，目的片段双酶切，然后按1:3-10酶连即可。载体模板至少要单酶切(防止P出来的载体还是环状的，比如我用的Phusion酶，如果不切就是) 发自小木虫Android客户端 |
2楼2019-03-01 09:57:58
多细胞11
新虫 (正式写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 4815.7
- 红花: 1
- 帖子: 425
- 在线: 65.1小时
- 虫号: 3822516
- 注册: 2015-04-20
- 专业: 微生物遗传育种学
3楼2019-03-01 09:59:34
4楼2019-03-01 22:39:53
