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急求：基因的洋葱表皮细胞定位失败的原因
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本人构建了一个含eGFP融合基因的植物表达载体，轰击洋葱表皮细胞后，未出现绿色荧光，请求各位有没有相似的经历，有没有没出现绿色荧光实验失败的文献可以参考，最好是有分析的失败的原因的文献，我需要查找失败的原因。必重谢，急求！ [ Last edited by 350784478 on 2009-9-19 at 12:50 ] |
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4楼2009-05-11 16:46:06
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trh(金币+15,VIP+0): 6-9 17:50
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我以前做过外源启动子+GFP轰击大麦叶片，有时候有表达，有时候表达很少或没有。是不是你的启动子不合适？或者启动子序列、GFP序列突变了？或者子弹做的时候出问题了：我做子弹的步骤如下，请参考： 金粉制备 （1） 称取60mg（金粉BioRad,1μm直径）或钨粉（m10）于1.5min离心管中； （2） 加入新鲜配制1ml70%乙醇，用旋涡混合器右超声充分震荡3~4min混合，静置1min； （3） 10000rpm离心5min，使金粉沉淀，去上清； （4） 重复以下步骤三次； ① 加入1ml消毒蒸馏水； ② 旋涡器震荡1min，静置1min； ③ 10000rpm离心2min，使金粉沉淀，去上清； （5） 加入灭菌的50%甘油，使金粉浓度达到60mg/ml。 子弹制备 （1） 旋涡震荡不少于5min，使在50%的甘油中金粉沉淀成为悬浮液； （2） 去掉粗堆集，取10 μl（3mg）悬浮混合液于1.5 ml离心管中； （3） 同时震荡，顺序加1-2 µg质粒DAN（1µg/1µl），10 µl 2.5M CaC12和4µl 0.1M亚精胺（现配）； （4） 继续震荡2~3min，静置1min； （5） 10000rpm离心2min，使金粉沉淀，去上清液； （6） 加入30µl 70%乙醇，不破坏沉淀块，弃去上清液； （7） 加入30µl 100%乙醇，不破坏沉淀块，弃去上清液； （8） 加入10µl 100%乙醇，指弹管壁几次，使之重新悬浮，然后低速旋涡2sec； （9） 每次取10µl放在载体中央，每次要尽量取出等量的（500µg）微粒子，并尽量做到均匀铺在载体膜（高温高压灭菌）中央1cm直径内，自然条件下干燥。 基因枪（BioRad PDS-1000/He）轰击 （1） 打开稳压电源，真空泵及氦气瓶阀的开关，瞬间针转氦气调节阀，调整系统压力为1300psi； （2） 按动真空健，抽真空至真空度为25~28Hg时，迅速按下Hold键，接着按住发射键，并保持不动，直到轰击为止，空放2~3枪； （3） 按通气键待真空表回零后，打开样品室门，开始在一次操作； （4） 取包被DNA的金粉悬浮液4µl均匀涂抹在无菌微弹载体膜的中央区域，于超净工作台吹干备用； （5） 将可裂膜放入可裂圆片的托座中，再将可裂圆片顺时针拧到气体加速上，用专用工具拧紧； （6） 将阻挡网先装入载体固定器的托座中，然后将涂有DNA的微薄弹药载体膜面朝上装入，旋紧固定盖，插入真空室上层部位； （7） 将受体材料小心的放入样品室，射程60㎜或90㎜，关好门； （8） 抽真空，轰击，排气，取样品，用封口膜将受体材料的培养皿封好； （9） 关机，把氦气瓶的总开关旋紧，打一次空枪，待氦气压表（2个表）的指针回零后，再逆时针旋转氦气压表调节阀，接着关闭基因枪的总开关及变压器开关； （10） 补充说明：点膜时金粉-DNA的悬浮液要充分悬匀；微弹载体上金粉DNA的分布是否则直接影响转化效率；维持一定真空度的时间尽量短。系统压力只比可裂膜爆裂压力高出50~200psi即可。 |
5楼2009-05-11 18:05:40
