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急求：基因的洋葱表皮细胞定位失败的原因
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本人构建了一个含eGFP融合基因的植物表达载体，轰击洋葱表皮细胞后，未出现绿色荧光，请求各位有没有相似的经历，有没有没出现绿色荧光实验失败的文献可以参考，最好是有分析的失败的原因的文献，我需要查找失败的原因。必重谢，急求！ [ Last edited by 350784478 on 2009-9-19 at 12:50 ] |
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xutao
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2楼2009-05-09 13:03:39
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我以前做过外源启动子+GFP轰击大麦叶片，有时候有表达，有时候表达很少或没有。是不是你的启动子不合适？或者启动子序列、GFP序列突变了？或者子弹做的时候出问题了：我做子弹的步骤如下，请参考： 金粉制备 （1） 称取60mg（金粉BioRad,1μm直径）或钨粉（m10）于1.5min离心管中； （2） 加入新鲜配制1ml70%乙醇，用旋涡混合器右超声充分震荡3~4min混合，静置1min； （3） 10000rpm离心5min，使金粉沉淀，去上清； （4） 重复以下步骤三次； ① 加入1ml消毒蒸馏水； ② 旋涡器震荡1min，静置1min； ③ 10000rpm离心2min，使金粉沉淀，去上清； （5） 加入灭菌的50%甘油，使金粉浓度达到60mg/ml。 子弹制备 （1） 旋涡震荡不少于5min，使在50%的甘油中金粉沉淀成为悬浮液； （2） 去掉粗堆集，取10 μl（3mg）悬浮混合液于1.5 ml离心管中； （3） 同时震荡，顺序加1-2 µg质粒DAN（1µg/1µl），10 µl 2.5M CaC12和4µl 0.1M亚精胺（现配）； （4） 继续震荡2~3min，静置1min； （5） 10000rpm离心2min，使金粉沉淀，去上清液； （6） 加入30µl 70%乙醇，不破坏沉淀块，弃去上清液； （7） 加入30µl 100%乙醇，不破坏沉淀块，弃去上清液； （8） 加入10µl 100%乙醇，指弹管壁几次，使之重新悬浮，然后低速旋涡2sec； （9） 每次取10µl放在载体中央，每次要尽量取出等量的（500µg）微粒子，并尽量做到均匀铺在载体膜（高温高压灭菌）中央1cm直径内，自然条件下干燥。 基因枪（BioRad PDS-1000/He）轰击 （1） 打开稳压电源，真空泵及氦气瓶阀的开关，瞬间针转氦气调节阀，调整系统压力为1300psi； （2） 按动真空健，抽真空至真空度为25~28Hg时，迅速按下Hold键，接着按住发射键，并保持不动，直到轰击为止，空放2~3枪； （3） 按通气键待真空表回零后，打开样品室门，开始在一次操作； （4） 取包被DNA的金粉悬浮液4µl均匀涂抹在无菌微弹载体膜的中央区域，于超净工作台吹干备用； （5） 将可裂膜放入可裂圆片的托座中，再将可裂圆片顺时针拧到气体加速上，用专用工具拧紧； （6） 将阻挡网先装入载体固定器的托座中，然后将涂有DNA的微薄弹药载体膜面朝上装入，旋紧固定盖，插入真空室上层部位； （7） 将受体材料小心的放入样品室，射程60㎜或90㎜，关好门； （8） 抽真空，轰击，排气，取样品，用封口膜将受体材料的培养皿封好； （9） 关机，把氦气瓶的总开关旋紧，打一次空枪，待氦气压表（2个表）的指针回零后，再逆时针旋转氦气压表调节阀，接着关闭基因枪的总开关及变压器开关； （10） 补充说明：点膜时金粉-DNA的悬浮液要充分悬匀；微弹载体上金粉DNA的分布是否则直接影响转化效率；维持一定真空度的时间尽量短。系统压力只比可裂膜爆裂压力高出50~200psi即可。 |
5楼2009-05-11 18:05:40
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贴个英文的我们一直按照这个做的，如果需要电子版的PROTOCOL请M我 Preparation for the Bombardment DNA Prepare a Midi-Prep of your plasmid DNA and adjust to a concentration of 1µg/µl Plant material Order e.g. barley plants one week prior you plan to do the bombardments and let them grow in a light chamber. Cut off the 7 days old leaves and place it on benzimidazol containing agar plates 4 hours before the bombardment and place them back into a light chamber. Washing microcarriers (gold particles) The following procedure prepares gold (micro carriers) for 10 bombardments. The micro carrier can be stored at 4°C for up to 2 weeks. Weigh out 30 mg of 1m gold micro carrier into a 1.5 ml eppi. Add 1 ml of 70% EtOH and vortex vigorously for 3 - 5 minutes on a platform vortexer. Allow the particles to sink for 15 minutes. Pellet the micro particles by spinning for 5 seconds at RT. Discard the supernatant Repeat the following wash step three times : Add 1 ml of sterile water. Vortex for 1 minute Allow the particles to settle for 1 minute. Pellet the micro particles by spinning for 5 seconds Remove the liquid and discard. Add 500 l sterilized 50%glycerol / 50% water to adjust the micro particle concentration to 60 mg/ml Coating micro carriers with DNA The following procedure prepares one bombardment. Coated micro carriers should be prepared 1 hour before using. Vortex the micro carrier prepared in 1:1 water/Glycerol for 5 minutes on a platform vortexer to resuspend and disrupt agglutinated particles. Remove 50 l of micro carriers while vortexing and add to a 1.5 ml eppi. While vortexing vigorously, add in order: 5 l DNA (1g / l) 50 l 2,5 M CaCl2 20 l 0,1 M Spermidine Continue vortexing for 2 - 3 minutes. Allow the micro carriers to settle for 1 minute. Pellet micro carriers by spinning for 2 seconds. Discard the liquid. Add 140 l 70% EtOH. Vortex at low speed for 2 seconds, spin for 2 seconds. Remove the liquid and discard. Add 140 l 100% EtOH. Vortex at low speed for 2 seconds, spin for 2 seconds. Remove the liquid and discard. Resuspend the coated gold particles in 60 l 100% EtOH. Keep on ice until using for bombardment. Bombardment Turn on the PDS1000/HE and the vacuum pump The first bombardment each day should be a "dry run" with no micro carrier to ensure that the system is set up properly and the gas pathway is filled with helium. (Procedure see below, but without samples) Each of seven macro carrier is placed inside a macro carrier holder, and fixed with the plastic insertion tool For each macro carrier, remove 7 l aliquots of micro carriers, pipet from a continuously vortexed tube and spread it on the macro carrier using a pipet tip The ethanol should evaporate completely Briefly wet the rupture disk in 2-propanol Turn the MC-holder upside down and intercalate the SS Holder with a clean Stopping Screen directly below the browser (platform2). Align the browser exactly above the macro carrier. Place the target shelf with the placed sample at the desired level inside the bombardment chamber (platform4). Close and latch the sample chamber door. Turn on the vacuum source Set the vacuum switch to the VAC position until 27 inches of mercury is reached and hold this level by quickly pressing the vacuum control switch through the middle VENT position to the bottom HOLD position. With the vacuum level in the bombardment chamber stabilized, press and hold the FIRE switch to allow the helium pressure inside the gas acceleration tube that is sealed by the selected rupture disc and observe the helium pressure gauge at the top of the acceleration tube, until the rupture disc bursts. Release the vacuum in the sample chamber by setting the VAC switch to the middle VENT position. Open the sample chamber door when the vacuum gauge reaches 0 inches of mercury of vacuum. After bombardment pick up the leaves, place it back on the petri dish 2.5 M CaCl2 stock solution Autoclave 0.1 M Spermidine (N-[3-Aminopropyl]-1,4butanediamine) SIGMA Order No.: S-4139,1g Dissolve 1 g spermidine with 67,80 ml water Sterilize by filtration Aliquot and store at -20°C 50% glycerol / 50% water (v/v) Autoclave 1% Agar, 85 M benzimidazol plates 100 x benzimidazol stock Sterile filter Rupture Disks, 900 psi Inbio Gold Cat.No.: BD900 Microcarreier BioRad Gold Particles, 1,0 micron Cat.No.: 1652225 Macrocarrier Inbio Gold Macrocarrier Cat.No.:BD042 [ Last edited by lynn5180 on 2009-6-10 at 22:19 ] |
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aga0110125
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