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wmwman306

禁虫 (著名写手)

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1)  3(上边的图)是以前跑的电泳,只有一条带
(2)(下边的图)是这段时间跑的电泳,怎么突然就出多条带呢?1的电泳还送去测序了,结果都测出来了?
(3)1和3都是同一个引物跑的,用其他的引物和其他的材料也是同样的结果。
   (4)    我把mg2+、dNTP、buffer、taq酶都换了。水做对照也是出同样的结果。

求教各位师长了。到底是哪方面出现问题呢?
我个人分析:
             (1) 0.5的TBE缓冲液出现问题。TBE缓冲液影响有这么大吗?
             (2)天气的影响,需要摸索条件。但是这个体系依然出带,提高退火温度只出一条带?

[ Last edited by 350784478 on 2009-10-1 at 13:14 ]
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smallcat227

木虫 (著名写手)

看不到图啊,还要钱的……
2楼2009-05-05 15:46:45
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biozheng

木虫 (小有名气)

用的同一台PCR仪??

建议重新摸索条件,提高特异性
3楼2009-05-05 15:50:38
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

模板多了
酶多了
退火低了
引物本身就不大好
之类的都有可能
不过像这种杂带,完全可以通过跑2%的胶分开
4楼2009-05-05 15:51:22
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wmwman306

禁虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by biozheng at 2009-5-5 15:50:
用的同一台PCR仪??

建议重新摸索条件,提高特异性

恩,用的同一台PCR仪。可以前用很多体系都出的,我的目的只要出一条带就行,呵呵。
   这个问题确实很愁人啊。
5楼2009-05-05 17:01:21
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wmwman306

禁虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2009-5-5 15:51:
模板多了
酶多了
退火低了
引物本身就不大好
之类的都有可能
不过像这种杂带,完全可以通过跑2%的胶分开

25ul体系:
     模板:约15ng
     Mg2+: 1.5mM
     dNTPs :0.2mM
     F、R引物各:0.32μmol/μl(10μ各加0.8μl)
    taqE:2U

应该不多啊,我之前用很高浓度的也出啊
6楼2009-05-05 17:07:12
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jqq1985

银虫 (正式写手)

PCR仪的温度不准吧,你用的是一台机器p的吗?
7楼2009-05-05 19:02:29
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hulqi

金虫 (正式写手)

做个TD-PCR,试试
8楼2009-05-05 23:33:20
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

用1个单位的酶试试
9楼2009-05-05 23:40:51
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wmwman306

禁虫 (著名写手)

恩,(1)做个梯度
       (2)减少酶量
10楼2009-05-06 08:47:37
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