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脂质工程结合酿酒酵母的系统代谢工程，使番茄红素高产量生产已有2人参与
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番茄红素（Lycopene）是植物中所含的一种天然色素，又称番茄烯，呈红色，属异戊二烯类化合物，是一种不含氧的类胡萝卜素，主要存在于茄科植物西红柿的成熟果实中。它是目前在自然界的植物中被发现的最强抗氧化剂之一。由于最早从番茄中分离制得，故称番茄红素。番茄红素具有优越的生理功能，它不仅具有抗癌抑癌的功效，而且对于预防心血管疾病、动脉硬化等各种成人病、增强人体免疫系统以及延缓衰老等都具有重要意义，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。 图1.番茄及番茄红素 酿酒酵母中番茄红素生物合成的系统代谢工程构建 为了构建能够产生和积累高水平亲脂性化合物的菌株，研究团队通过六个传统的代谢工程步骤开发了一种过量产生番茄红素的酿酒酵母菌株：1）增强内源性上游甲羟戊酸（MVA）途径；2）产生番茄红素的酶的异源表达；3）乙酰辅酶A前体产生的增强；4）氧化还原辅因子NADPH的再生；5）异源调节番茄红素合成基因的表达；以及6）敲除影响类胡萝卜素积累的功能性旁路基因。  图2番茄红素生物合成中的关键通量的简化示意图表示与酿酒酵母中的 TAG代谢相结合。产生乙酰辅酶A的途径以黄色矩形突出显示。与TAG合成相关的反应以红色矩形突出显示。番茄红素 - 生物合成通量以绿色矩形突出显示。 甘油三酯（TAG）生物合成的工程改造以增加TAG含量和番茄红素积累 研究团队观察到酿酒酵母中产生的番茄红素在脂滴（LD）中积累，并且增加的产量导致番茄红素在整个细胞质中扩散。因为酿酒酵母中的脂质生成低于产油宿主，研究团队假设脂质生产有助于微生物中细胞内亲脂性产物如番茄红素的积累。为了研究脂质和番茄红素合成之间的相关性，设计了TAG的代谢，TAG是LD核心的主要中性脂质。通过过表达三种关键酶，即内源PAH1，DGA1和编码ACC1 S659AS1157A的突变ACC1变体，设计了高产番茄红素产生菌株TM606以过量产生TAG。，在强启动子P PGK1和P TEF1的控制下得到的菌株（TM60656）显示出TAG产量增加74.9mg / g cdw（图 3D）和番茄红素产量增加61.7mg / g cdw（图 3B），大多数TM60656细胞中的番茄红素观察到液滴而不是分散在整个细胞质中（图 3C）。这些结果表明，增加TAG产量显着促进番茄红素积累增加。  图3. 产番茄红素菌株TM606中脂质合成的代谢工程。（A）脂质代谢工程策略。（B）番茄红素积累。（C）番茄红素在表现出不同积累水平的菌株中的分布。在488nm 处存在（右）和不存在（左）荧光激发的结果。（D）TAG积累。（E）增加TAG中的UFA成分。* P <0.05; ** P <0.01。 删除FLD1（内质网膜蛋白）可改善番茄红素的积累 在本研究中，菌株TM70756中的FLD1缺失产生菌株TM70456导致TAG产量增加至73.5 mg / g cdw并且番茄红素积累增加至70.5 mg / g cdw（图3） B）。并且细胞具有针状形态的番茄红素（图 3C）。研究结果表明，通过操纵TAG含量和不饱和脂肪酸（UFA）组成并在高产番茄红素生产菌株中调节LD大小，成功开发了一种有效的脂质平台，使番茄红素产量增加了25％。目前来说，这代表了迄今为止报道的酿酒酵母中番茄红素的最高产量。 用于番茄红素生产的高密度发酵 研究团队在高密度细胞发酵过程中使用了两个阶段的细胞生长和产物积累，这些阶段通过采用改进的半乳糖（GAL）调节系统分离并控制碳源的供应。在第一阶段进料后，28 小时后生物量达到98 的OD 600 ，没有观察到细胞颜色的变化。在涉及乙醇的第二个喂养阶段，我们观察到TAG积累最初增加，并且在发酵的中晚期减少。番茄红素的积累显着增加，尽管生物量仅略有增加，并且细胞中番茄红素的形态从小液滴变为针状结构。结果表明，番茄红素持续累积至2.37 g / L和73.3 mg / g cdw直至发酵完成（图4）。这些结果表明，番茄红素含量的积累远高于先前在工程的酿酒酵母菌株或天然番茄红素生产者如番茄。  图4.用于番茄红素生产的高密度发酵。时间过程显示细胞生长，番茄红素和TAG产生的变化，以及补料分批发酵期间TM70456细胞的微观形态。 这项研究是迄今为止在含油生物或酿酒酵母中番茄红素报道的最高产量，因为番茄红素的毒性高于β-胡萝卜素，含油生物在脂质生产过程中使用大量葡萄糖，所以，我们在酿酒酵母中实施了脂质生产，通过管理葡萄糖向与脂质和番茄红素生产相关的途径的有效转移，从而避免由于更高的葡萄糖消耗和促进更节能的过程而产生过多的脂质。同时在针状结构中产生番茄红素的最佳菌株（TM70456）使得在发酵阶段之后更容易纯化，从而潜在地降低了番茄红素在工业生产期间从含油生物中的大量脂质中分离的成本。这也是使用非含油生物进行此类产品的工业生产发酵的一个非常好的例子。 |
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2018-12-06 10:35:03, 1.22 M
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