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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 【求助】PVDF膜的本底问题
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wdwd123

铁杆木虫 (知名作家)

[交流] 【求助】PVDF膜的本底问题

各位大哥大姐，谁用过PVDF膜呀？我做的是抗体膜芯片，我用5%的脱脂牛奶封闭，常温下2-3个小时或4度过夜，还有很高的本底。
    大家做western-blotting的时候也用PVDF膜呀，好像文献上说封闭效果都很好啊，为什么我那样做就不行呢？
    我是这样做的，先用5%牛奶封闭，然后点二抗上去，TBST洗后，再加底物，结果却显色了，按理说，不该显色啊。
    等等，中间有很多问题，希望大家给点建议。
    如果有同行，我们交流下：506932097
      也希望做western的朋友们给点建议。
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1楼 2009-04-24 21:27:49
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wdwd123(金币+10,VIP+0): 5-20 11:20
我想封闭本身没有任何问题，我师弟上次和你一样也本底很严重。我诊断了他的各个操作程序，发现他漂洗时太节省TBST溶液，导致漂洗不够彻底，结果是膜上残留了一抗以及结合的二抗，最终产生很强的本底。你如果真想请教和搞清原因，劝你讲清楚自己的每步操作细节，非常重要的是显色步骤，而你连方法都没描述！
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《memory》---BarbaraStreisand
7楼2009-05-17 16:19:55
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missyouwq

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
wdwd123(金币+5,VIP+0):谢谢 4-25 17:01
我不懂，但是帮你顶顶帖子，看你挺着急的
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锲而不舍，天道酬勤
2楼2009-04-25 13:38:42
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wdwd123(金币+10,VIP+0):谢谢 4-25 17:00
跟显色方法有关系,如果你用DAB反应时间稍长本底就重.ECL溶液如果不太合适，或者过期可能会出现这种情况.当然,也不确定你的膜效果怎样,我们用minipore的5%的脱脂牛奶封闭常温一个小时就不会出现本底，TBST漂洗三次/5分钟就能洗得干净。

[ Last edited by meizhou on 2009-4-25 at 16:41 ]
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《memory》---BarbaraStreisand
3楼2009-04-25 16:34:44
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meizhou

木虫 (知名作家)

沉墨于心，不没于物
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
wdwd123(金币+10,VIP+0): 4-25 17:00
你的意思是说你没加一抗，结果却显色了？
卖糕的！是不是操作过程中你的膜被污染了？
建议你换用minipore，伯乐或者roche的膜试试看，我们从没从过假阳性这种情况。
当然，提醒你漂洗时TBST溶液尽量多一些，时间可以延长。其实封闭45分钟基本就够，如果脱脂奶没问题的话。
赞一下(8人) 回复此楼
《memory》---BarbaraStreisand
4楼2009-04-25 16:39:13
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