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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于接合转移的问题
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

[交流] 关于接合转移的问题

我将构建好的质粒转化ET12567,然后用这个菌与东方拟无枝酸菌接合转移，但是现在接合转移做了好久，都没出现好的结果，年底就毕业了，很着急，有哪位接合转移方面的经验的，望指导一下，有没有什么好的建议，感激不尽了！
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1楼 2009-04-23 13:03:50
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
我现在的问题是：
     将构建好的一个质粒（大约8500bp)转化大肠杆菌ET12567,用的是CaCl2法制备ET12567感受态，菌液PCR验证、提取质粒酶切验证均正确，将验证正确的菌用20％甘油保存在－20度；
      此时问题出现了：将甘油保藏管菌液重新接LB小试管（含抗性），提质粒，但是此时却见不到质粒的条带了，Why？（ps:提质粒用的试剂是别人刚刚提过质粒的，应该没问题；LB小试管菌长得很好很正常）。我也试过将甘油保藏管菌液先在LB（含同样抗生素）平板活化，然后再接小试管提质粒，结果电泳也没见到我所要的质粒条带（PS：电泳和别人一起跑的，别人的有条带，电泳应该是没问题的）
     我的ET12567是RecA缺陷型的，现在和实验室的师兄师姐讨论了一下，不知道是不是因为安普抗生素的问题（安普抗生素固体粉末冻存在－20度的时间比较长了，有几年了吧，会不会是效价变低了呢？),但是我单独将ET12567接在含三种抗性的LB液体里面，是不长的，这到底是怎么回事呢？
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2楼2009-04-23 13:06:03
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
请大侠们给点建议哈
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3楼2009-04-23 15:35:05
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jiaminl

铁杆木虫 (知名作家)
不是很清楚

希望高手帮忙顶
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Nevergiveup!
4楼2009-04-24 08:17:02
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
高手帮忙看看哦
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5楼2009-04-24 13:37:32
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hulqi

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
zhaoxiag(金币+3,VIP+0):谢谢哦 5-3 13:56
首先，一般质粒丢失是由于选择压力（这里你是安普抗生素）有问题导致的,换新的安普抗生素试一下。
其次感受态最好是买试剂公司 的，以前我们也是自己用冰冻的氯化钙自己做，但是效果很差很不稳定，买的成品就好很多，这个不是很贵。
再有就是菌冷冻保藏需要程序降温，最好现在4摄氏度放一段时间后再放入负20摄氏度。直接放入负20摄氏度，对菌复苏后的性能肯定有影响。
但是就你的问题来看，选择压力有问题的可能性很大，安普抗生素效价降低会导致菌传代时质粒丢失……
个人看法，仅供参考~~
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6楼2009-04-24 14:12:04
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
大家帮忙看看啊，谢谢咯
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7楼2009-05-05 09:34:54
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)
大牛们帮忙看看哦，非常感谢！
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8楼2009-05-06 21:07:45
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hzaudxm

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
菌在抗生素的LB里是长了，会不会是这株菌本身就抗这种抗生素？当时应该保存好质粒的。
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9楼2010-03-27 16:31:09
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ddzhang@

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
安普抗生素     效价低了
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10楼2010-03-27 16:57:18
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