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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

[交流] 关于接合转移的问题

我将构建好的质粒转化ET12567,然后用这个菌与东方拟无枝酸菌接合转移,但是现在接合转移做了好久,都没出现好的结果,年底就毕业了,很着急,有哪位接合转移方面的经验的,望指导一下,有没有什么好的建议,感激不尽了!
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

我现在的问题是:
     将构建好的一个质粒(大约8500bp)转化大肠杆菌ET12567,用的是CaCl2法制备ET12567感受态,菌液PCR验证、提取质粒酶切验证均正确,将验证正确的菌用20%甘油保存在-20度;
      此时问题出现了:将甘油保藏管菌液重新接LB小试管(含抗性),提质粒,但是此时却见不到质粒的条带了,Why?(ps:提质粒用的试剂是别人刚刚提过质粒的,应该没问题;LB小试管菌长得很好很正常)。我也试过将甘油保藏管菌液先在LB(含同样抗生素)平板活化,然后再接小试管提质粒,结果电泳也没见到我所要的质粒条带(PS:电泳和别人一起跑的,别人的有条带,电泳应该是没问题的)
     我的ET12567是RecA缺陷型的,现在和实验室的师兄师姐讨论了一下,不知道是不是因为安普抗生素的问题(安普抗生素固体粉末冻存在-20度的时间比较长了,有几年了吧,会不会是效价变低了呢?),但是我单独将ET12567接在含三种抗性的LB液体里面,是不长的,这到底是怎么回事呢?
2楼2009-04-23 13:06:03
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

请大侠们给点建议哈
3楼2009-04-23 15:35:05
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jiaminl

铁杆木虫 (知名作家)

不是很清楚

希望高手帮忙顶
Nevergiveup!
4楼2009-04-24 08:17:02
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

高手帮忙看看哦
5楼2009-04-24 13:37:32
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hulqi

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
zhaoxiag(金币+3,VIP+0):谢谢哦 5-3 13:56
首先,一般质粒丢失是由于选择压力(这里你是安普抗生素)有问题导致的,换新的安普抗生素试一下。
其次感受态最好是买试剂公司 的,以前我们也是自己用冰冻的氯化钙自己做,但是效果很差很不稳定,买的成品就好很多,这个不是很贵。
再有就是菌冷冻保藏需要程序降温,最好现在4摄氏度放一段时间后再放入负20摄氏度。直接放入负20摄氏度,对菌复苏后的性能肯定有影响。
但是就你的问题来看,选择压力有问题的可能性很大,安普抗生素效价降低会导致菌传代时质粒丢失……
个人看法,仅供参考~~
6楼2009-04-24 14:12:04
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

大家帮忙看看啊,谢谢咯
7楼2009-05-05 09:34:54
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zhaoxiag

银虫 (小有名气)

大牛们帮忙看看哦,非常感谢!
8楼2009-05-06 21:07:45
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hzaudxm

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
菌在抗生素的LB里是长了,会不会是这株菌本身就抗这种抗生素?当时应该保存好质粒的。
9楼2010-03-27 16:31:09
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ddzhang@

新虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
安普抗生素     效价低了
10楼2010-03-27 16:57:18
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