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关于接合转移的问题
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| 我将构建好的质粒转化ET12567,然后用这个菌与东方拟无枝酸菌接合转移，但是现在接合转移做了好久，都没出现好的结果，年底就毕业了，很着急，有哪位接合转移方面的经验的，望指导一下，有没有什么好的建议，感激不尽了！ |
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我现在的问题是： 将构建好的一个质粒（大约8500bp)转化大肠杆菌ET12567,用的是CaCl2法制备ET12567感受态，菌液PCR验证、提取质粒酶切验证均正确，将验证正确的菌用20％甘油保存在－20度； 此时问题出现了：将甘油保藏管菌液重新接LB小试管（含抗性），提质粒，但是此时却见不到质粒的条带了，Why？（ps:提质粒用的试剂是别人刚刚提过质粒的，应该没问题；LB小试管菌长得很好很正常）。我也试过将甘油保藏管菌液先在LB（含同样抗生素）平板活化，然后再接小试管提质粒，结果电泳也没见到我所要的质粒条带（PS：电泳和别人一起跑的，别人的有条带，电泳应该是没问题的） 我的ET12567是RecA缺陷型的，现在和实验室的师兄师姐讨论了一下，不知道是不是因为安普抗生素的问题（安普抗生素固体粉末冻存在－20度的时间比较长了，有几年了吧，会不会是效价变低了呢？),但是我单独将ET12567接在含三种抗性的LB液体里面，是不长的，这到底是怎么回事呢？ |
2楼2009-04-23 13:06:03
3楼2009-04-23 15:35:05
jiaminl
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