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三种修复抗原方法之比较
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免疫组化染色的实质是抗原抗体反应，即用特异性抗体识别组织和细胞中的相应抗原，不少医药研发公司提供免疫组化染色服务。然而由于现在使用广泛的病理标本固定液甲醛能够形成醛键和羧甲基并且能够使蛋白发生交联而封闭抗原决定簇，从而影响染色结果。因此免疫组化染色前需要对组织切片中的抗原进行修复。 抗原修复技术的进步，促进了免疫组化染色服务机构提供的病理诊断的提高，有助于帮助评价肿瘤的增生程度和分期，对病人的治疗、预后等方面起到了指导作用。抗原修复的目的就是用化学或物理的方法使被封闭的抗原决定簇重新暴露出来。 外检组织经过甲醛固定、脱水透明及浸蜡过程，组织中的抗原成分已被破坏或封闭，为了恢复组织的抗原性和提高组织对抗体的敏感性，一般需修复抗原。有人用蛋白酶消化，或微波处理，或高压锅处理，使封闭的抗原成分暴露出来而显色。采用高温高压处理切片，切片在弱酸及高温高压下，使封闭的抗原显示出来，提高了阳性检出率和阳性强度，同时减轻了背景着色，使阳性结果清晰可辨。当然，不同组织、不同抗原其所用的高压时间及选用合适的抗原修复缓冲液及其最适的PH等均对结果影响甚大。 免疫组化染色是医学和生命科学研究中经常要使用的研究方法，在中国CRO公司排名靠前的美迪西，提供免疫组化染色服务。在免疫组化技术的抗原修复中，常用的方法有酶修复法、高温高压修复法和微波修复法三种。 1、酶修复法 酶修复法常常会使用用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前需要预热37℃，消化时间约为5-30分钟。这种方法适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。蛋白酶消化法对抗原的选择性强，需要针对不同的抗原选择不同的消化酶，而且消化酶对某些膜抗原、激素受体、癌基因及部分淋巴细胞抗原不仅没有增强作用，相反有破坏作用，重者细胞结构受损，还可增加某些抗原的弥散，不利于定位观察。 2、高温高压修复法 高温高压抗原修复是目前使用较多、较稳定、可重复性高的一种方法。然而，高温高压修复方法虽然最高修复温度一致，但冷却方法却各不相同，常见的自然冷却和快速冷却（出气3分钟后用冷水迅速冲冷）是否影响免疫组化结果呢。研究者通过比较试验，确定了两种不同的冷却方法造成的实际修复时间具有显著差异，并通过平衡抗原修复时间，使热条件在达到相对一致的情况下，检验仅仅快速冷却的单因素是否导致免疫组化结果的阳性强度降低。 结果表明，室温、缓冲液的量以及压力锅的大小均影响自然冷却时间，造成免疫组化结果的不稳定；而高压修复快速冷却方法中，缓冲液的量和染色强度没有显著关系，且室温、压力锅大小对冷却时间的影响也很小。因此，研究者认为，高温高压快速冷却方法是免疫组化抗原修复稳定的方法，有助于免疫组化操作的规范化和免疫组化结果的稳定性。 为探讨免疫组化反应中的高温高压抗原修复法预处理方法对反应结果的影响。有研究者对60份经10%中性甲醛液固定过的乳腺癌组织，经脱水、石蜡包埋制成切片，分别采用高温高压抗原修复法和微波炉抗原修复法做预处理后，进行免疫组化染色。结果发现石蜡组织切片免疫组化反应预处理，采用高温高压抗原修复法，其阳性率为55.8%，采用微波炉抗原修复法，其阳性率为45.4%。 免疫组化反应中采用高压高温抗原修复法作预处理,石蜡组织切片阳性表达率较微波炉抗原修复法明显提高(P<0.05)。因此预处理采用高温高压抗原修复法，提高了免疫组化阳性率的表达，显色对比鲜明，背景干净清晰，从而提高病理诊断的准确率。 3、微波修复法 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本。 4、三种抗原修复方法比较 为探讨不同抗原修复方法对免疫组织化学反应结果的影响，以提高免疫组织化学染色阳性率。方法是分别采用3种不同抗原修复方法作预处理后，进行Envision免疫组织化学二步法检测10种常用抗体的免疫组织化学染色效果。 结果发现石蜡组织切片，免疫组织化学反应的抗原修复方法预处理，采用高温高压抗原修复法，与微波抗原修复法及煮沸抗原修复法染色强度有明显差异，高温高压抗原修复法明显优于微波法及煮沸法，因此预处理采用高温高压抗原修复法，既可提高免疫组织化学反应阳性表达率，又能提高制片质量，可以一次性用于大量组织切片，是一种理想的免疫组织化学反应的抗原修复预处理方法。 目前提高免疫组化敏感性主要有两种途径，一是增加免疫组化方法的敏感性，二是对石蜡组织切片中被封闭的抗原进行修复，从而提高抗体检测的敏感性。在免疫组化实验中，抗原修复技术是影响染色结果的关键因素。抗原修复技术促进了免疫组织化学的敏感性的提高，使得反应结果更加准确可靠。 |
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