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dulei木虫 (小有名气)
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求助连接问题！！！
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我用Xba I和Nde I双酶切质粒PIB139，小片段很小（10bp），直接用纯化试剂盒回收纯化大片段（6000bp左右）。 用Xba I和Nde I双酶切质粒pTA2-Vgb质粒（在T载体pTA2上连了一个vgb基因，酶切位点都有，测序正确），回收500bp左右的vgb片段。 然后将酶切后的PIB139和vgb片段连接，可是连接了好几次都没有连接上。连接体系应该没有问题，做其它基因连接时，都很好就连上了。 跑胶验证过程，发现：回收的vgb基因片段量非常少，不知道是不是这个原因。 切胶时发现vgb片段的量还是挺多的，可是回收后就很少很少了，跑胶5uL都很难看见条带。是不是因为vgb条带太短（500bp左右），损失太大的原因啊。 Nde I酶切效率很低，切开的位点连接效率也很低，我用的是长时间的连接（和平末端连接时间差不多，2个小时左右）。但是一个菌落都不长。 有没有人连接过Xba I和Nde I双酶切产物的，麻烦说明一下连接步骤，越详细越好。在此谢过！！！！ |
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