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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 询问怎么做未知物种某个已知酶的mRNA表达
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xiaorong-er

金虫 (正式写手)

[交流] 询问怎么做未知物种某个已知酶的mRNA表达

我现在想做一个酶的mRNA表达情况，但是这个物种的cDNA序列没有报道，我该怎么做？是不是根据人和鼠的保守区设计引物，挑选合适的引物和退火温度进行PCR扩增，扩增产物测序后根据测序序列进行引物设计，再挑选合适的引物和退火温度进行PCR扩增就可以了？
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1楼 2009-04-20 08:47:21
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
xiaorong-er(金币+1,VIP+0): 4-21 08:21
你把用非特异性引物扩出的条带大小在你估计的范围内的送去测序，序列出来后Blast看一下是否确实是你的目的基因扩出来的序列，如果是再根据已知序列重新设计引物，此时目的条带200bp就可以了，用新设计的引物进行定量或半定量的实验。

如何知道目的片段的大小，设计兼并性引物（非特异性引物时）你看看在相似基因上从上游引物到下游引物究竟有多少BP就可以粗略估计你的目的片段大小，
相似基因上碱基有差异，但是序列长度不会相差太大。

[ Last edited by gastrodia on 2009-4-20 at 18:36 ]
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6楼2009-04-20 18:34:30
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
xiaorong-er(金币+2,VIP+0): 4-20 09:52
差不多是这样，在ncbi上面有conserve的信息，保守区的选择应该再多看几个物种，这样成功率会高一些
建议现在UCSC上面看保守性先大致定位，然后再用多物种序列比对看看应该放在哪里比较好
注意引物的3端尽量能够放在高度保守区
引物可以设计稍微短一点，待切胶测完序再决定引物设计
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2楼2009-04-20 09:39:00
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
xiaorong-er(金币+1,VIP+0): 4-20 14:54
你先根据保守区兼并性引物，去扩，会得到很多条带，将得到的片段测序，通过Blast确定是否能得到你的目的片段，如果可以，就可以进行定量或半定量的实验
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3楼2009-04-20 11:04:04
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xiaorong-er

金虫 (正式写手)
我怎么知道设计的引物好不好呢？现在我是按照这样做的，32个循环扩没有看到很多非特异性条带，但是不亮，后来用35个循环扩的时候条带很亮，非特异形条带也很多。我的目的片段扩出来的大小是不是根据设计的引物（下游位置-下游位置）*2来确定？
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4楼2009-04-20 15:36:48
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