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挥汗如雨至尊木虫 (职业作家)
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[交流]
求助双链RNA浓度测定问题
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请教各位高手，我以PCR产物为模板，做完体外转录，退火形成双链RNA（dsRNA）后，加DNase和RNase进行核酶消化，降解PCR产物模板和单链RNA，然后纯化dsRNA，测定260 nm处的OD值计算合成的dsRNA浓度。 但我发现有些人是利用乙醇沉淀的方法纯化dsRNA，测定260 nm处的OD值计算合成的dsRNA浓度的，请问这样做测出的浓度合理吗？乙醇沉淀能否去除核酶消化和剩余的dNTP？如果去除不了，核酶消化和剩余的dNTP对测定的OD值是不是影响很大？这样测出的dsRNA浓度应该偏大吧？或者说如果不去除dsRNA以外的核酸片段或dNTP,测出的ＯＤ值和合成dsRNA反应前的ＯＤ值没有什么区别？如果利用过柱纯化的方法是否能去除剩余的，核酶消化和剩余的dNTP？ （乙醇沉淀方法：PCR结束后，加入0.1倍体积醋酸钠（3M，Ph5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，冰浴10 min，12000 rpm离心10 min；轻轻倒掉上清，再加500 μl 75%乙醇洗涤。4℃，7500 rpm离心5 min，再倒掉上清，干燥沉淀；加入无菌水溶解纯化的PCR产物，紫外分光光度计测定260 nm处的吸光度，计算反应产物浓度） |
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