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含笑~

银虫 (正式写手)

[交流] PCR优化

50.00UL体系用20uM的引物1.00UL，Taq 1.25U。结果：目的条带很亮（约200kb），出现约400bp的非特异条带，有引物二聚体。（第一张图）
50.00UL体系用20uM的引物0.50UL，Taq 1.25U。结果：目的条带比较亮，400bp非特异减少,有引物二聚体。（第二张图）
50.00UL体系用20uM的引物0.25UL，Taq 1U。结果：无400bp非特异，引物二聚体也没有了，但目的条带不够亮。（第三张图）
PS 为了减少非特异，用过TOUNCHDOWN，但目的条带很弱，引物二聚体明显。根据以上结果，怎样才能得到更好的PCR效果呢。

[ Last edited by 含笑~ on 2009-4-14 at 13:08 ]
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1楼 2009-04-14 10:30:57
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spring0304

木虫 (小有名气)
对于目的片段，直接割胶回收！
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3楼2009-04-14 10:57:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
在克隆实验中，dimer和非特异条带是很正常的，反正要切胶回收，只要目的条带够浓就可以了，其他有杂带无所谓，只要能分开。

至于想做定量或半定量PCR，则最好先从引物入手，引物设计不好怎么优化都没用
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2楼2009-04-14 10:37:11
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含笑~

银虫 (正式写手)

回复三磷酸腺苷和spring0304

谢谢你们的回复！我是准备分析样品的微生物多样性，先扩16S rDNA中的V3区，然后跑变性梯度凝胶电泳（DGGE），跑DGGE后再切胶回收。以上的图片是Agarose 胶的，是在跑DGGE前先跑agarose 看看的，不直接回收。不知是否可以先回收agarose胶之后再跑DGGE？
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4楼2009-04-14 13:18:27
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