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含笑~

银虫 (正式写手)

[交流] PCR优化

50.00UL体系用20uM的引物1.00UL,Taq 1.25U。结果:目的条带很亮(约200kb),出现约400bp的非特异条带,有引物二聚体。(第一张图)
50.00UL体系用20uM的引物0.50UL,Taq 1.25U。结果:目的条带比较亮,400bp非特异减少,有引物二聚体。(第二张图)
50.00UL体系用20uM的引物0.25UL,Taq 1U。结果:无400bp非特异,引物二聚体也没有了,但目的条带不够亮。(第三张图)
PS 为了减少非特异,用过TOUNCHDOWN,但目的条带很弱,引物二聚体明显。根据以上结果,怎样才能得到更好的PCR效果呢。

[ Last edited by 含笑~ on 2009-4-14 at 13:08 ]
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

在克隆实验中,dimer和非特异条带是很正常的,反正要切胶回收,只要目的条带够浓就可以了,其他有杂带无所谓,只要能分开。

至于想做定量或半定量PCR,则最好先从引物入手,引物设计不好怎么优化都没用
2楼2009-04-14 10:37:11
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spring0304

木虫 (小有名气)

对于目的片段,直接割胶回收!
3楼2009-04-14 10:57:48
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含笑~

银虫 (正式写手)

回复三磷酸腺苷和spring0304

谢谢你们的回复!我是准备分析样品的微生物多样性,先扩16S rDNA中的V3区,然后跑变性梯度凝胶电泳(DGGE),跑DGGE后再切胶回收。以上的图片是Agarose 胶的,是在跑DGGE前先跑agarose 看看的,不直接回收。不知是否可以先回收agarose胶之后再跑DGGE?
4楼2009-04-14 13:18:27
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