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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 交流求助：TA克隆载体
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亦木水

铜虫 (小有名气)

[交流] 交流求助：TA克隆载体

前段时间刚把RNA-PCR做出来，得到目的片段，现在进行TA克隆时又遇到问题了。
我的目的片段是2500kb，用的是PMD-18T载体，可就是连完转化后挑的菌做酶切鉴定没结果。连接条件是4℃过夜。
是不是片段大了很难连上T载体？

[ Last edited by 亦木水 on 2009-4-27 at 13:36 ]
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1楼 2009-04-13 12:26:20
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198619

铜虫 (小有名气)
你说的问题应该不存在吧！
我用的也是和你一样的载体，可是连接条件是16℃30分钟以上，一般我是连接3-4小时
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2楼2009-04-13 12:40:26
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亦木水

铜虫 (小有名气)
我们实验室以前做连接都是放4℃冰箱过夜的，都可以
所以这次我有点认为是片段的大小问题，
改天我用16℃试试吧
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3楼2009-04-13 12:55:15
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speker

铁虫 (初入文坛)
还早呢，PMD18可以连接6k的片段，你还是先优化优化你的连接体系吧，外援片段浓度稍微大一点会比较好一些。
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4楼2009-04-13 13:47:53
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黑皮猩猩

铜虫 (初入文坛)
16℃一般过夜
22℃就一个小时
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5楼2009-04-13 16:51:03
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亦木水

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by speker at 2009-4-13 13:47:
还早呢，PMD18可以连接6k的片段，你还是先优化优化你的连接体系吧，外援片段浓度稍微大一点会比较好一些。

连接体系的优化是哪些方面呢？
连接体系的体积
DNA的量与载体的量
连接温度与时间

还有么？
不知道大片段连接时是怎么一个情况
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6楼2009-04-13 23:04:20
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亦木水

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 黑皮猩猩 at 2009-4-13 16:51:
16℃一般过夜
22℃就一个小时

我这次用16℃连接过夜的，后面转化测序结果还是空载。

纠结。。。。
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7楼2009-04-23 12:39:22
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
试试promega的T-easy吧
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8楼2009-04-23 12:53:40
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cascc

铜虫 (小有名气)
首先保证你如果选用了高保真酶，注意反应后加A.
按照solution1 5ul，载体1ul，回收片段4ul。
其次，2.5k连接没有问题，建议适当增加连接时间，可以放在16度过夜。
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9楼2009-04-24 21:50:53
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