应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急！！！PCR扩增长片段
71/1返回列表
查看: 1145  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Bena1019

新虫 (初入文坛)

[求助] 急！！！PCR扩增长片段 已有2人参与

PCR扩增11000左右片段，上下游引物tm差十几度（因为下游引物要扩的片段gc含量很高所以下游引物tm高（78度）上游（64度）），要么跑不出结果，要么非特异性条带（2000多bp），我该怎么优化？下游引物没法再短了（16bp了）

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2018-10-08 11:09:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2018-10-08 11:11:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

macgray11

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
3楼2018-10-08 11:13:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Bena1019

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Eternity宇 at 2018-10-08 11:11:24
78和64……你这退火温度也太高了吧

这是没办法了，引物序列不能改的，只能要么延长要么缩短

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2018-10-08 11:14:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Bena1019

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by macgray11 at 2018-10-08 11:13:52
建议楼主分成大片段扩增，或者用Takara的Primer-Star专门扩高GC的试试，应该有效果的

用的就是primer star，但是不行，我不知道哪里有问题，可以调整哪里，体系还是PCR条件

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
5楼2018-10-08 11:17:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
关于长片段和高GC，可以试试以下的两步法程序
参考的两步法程序：
98℃     5min
98℃     15s
74℃     20s/kb   5 Cycles
98℃     15s
72℃     20s/kb    5 Cycles
98℃     15s
70℃     20s/kb    5 Cycles
98℃     15s
68℃     20s/kb    20 Cycles
68℃     5-10min

如果不灵，建议重新设计引物，巢式PCR；
或者使用分段扩增，11k毕竟是有点长，不好扩增（扩增出来，产量也可能低）
赞一下 回复此楼
*才随遇长，识以穷精*
6楼2018-10-08 12:47:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

macgray11

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2018-10-09 08:30:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Bena1019 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭