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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 急！！！PCR扩增长片段
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Bena1019

新虫 (初入文坛)

[求助] 急！！！PCR扩增长片段 已有2人参与

PCR扩增11000左右片段，上下游引物tm差十几度（因为下游引物要扩的片段gc含量很高所以下游引物tm高（78度）上游（64度）），要么跑不出结果，要么非特异性条带（2000多bp），我该怎么优化？下游引物没法再短了（16bp了）

@biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2018-10-08 11:09:30
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
2楼2018-10-08 11:11:24
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macgray11

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
3楼2018-10-08 11:13:52
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Bena1019

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Eternity宇 at 2018-10-08 11:11:24
78和64……你这退火温度也太高了吧

这是没办法了，引物序列不能改的，只能要么延长要么缩短

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4楼2018-10-08 11:14:41
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Bena1019

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by macgray11 at 2018-10-08 11:13:52
建议楼主分成大片段扩增，或者用Takara的Primer-Star专门扩高GC的试试，应该有效果的

用的就是primer star，但是不行，我不知道哪里有问题，可以调整哪里，体系还是PCR条件

发自小木虫Android客户端
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5楼2018-10-08 11:17:50
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ghst110

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
关于长片段和高GC，可以试试以下的两步法程序
参考的两步法程序：
98℃     5min
98℃     15s
74℃     20s/kb   5 Cycles
98℃     15s
72℃     20s/kb    5 Cycles
98℃     15s
70℃     20s/kb    5 Cycles
98℃     15s
68℃     20s/kb    20 Cycles
68℃     5-10min

如果不灵，建议重新设计引物，巢式PCR；
或者使用分段扩增，11k毕竟是有点长，不好扩增（扩增出来，产量也可能低）
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*才随遇长，识以穷精*
6楼2018-10-08 12:47:04
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macgray11

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
7楼2018-10-09 08:30:16
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