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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 急！酵母中半乳糖诱导表达
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silence0919

新虫 (小有名气)

[求助] 急！酵母中半乳糖诱导表达

最近用BY4741转化pESC-Leu载体做表达， 在SD缺Leu的培养基上筛选，2天后能够看到大量很明显的转化子（用加水的BY4741感受态做对照不长）。但是用半乳糖诱导，破菌后SDS-PAGE跑上清沉淀，看不到目的蛋白，空载体和质粒跑得SDS-PAGE差不多结果。初步推测应该是没有诱导成功。尝试过下列几种诱导方式：
1.SD培养基上转化子转到YPD培养基摇过夜， 转移到大量YPD培养基再次摇过夜，离心得到菌体再转移到YPG培养基上，16度诱导过夜。其中OD600监测不低于0.6.
2.转化子转到液体SD培养基摇过夜，离心，菌体中加入SG培养基诱导过夜
3.转化子 接到SD（无galactose）, YP(无galactose)两种培养基中分别培养1小时后，加棉子糖和galactose做诱导培养
诱导温度都是16度过夜，也试过一次25度6小时
基本上都看不到目的蛋白~

求助大神 到底是哪里除了问题？或者是不是需要做western验证？
请各位不吝赐教，感激不尽~~~
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1楼 2018-09-18 22:10:22
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maoniuniu

新虫 (小有名气)
BY4741是单倍体？很久不做酵母了，以前用过BY4743。一缺长，看上去转进去了，不能只用SDS-PAGE来检测，无论哪个表达系统，因为不知道表达的丰富如何，除非是别人做过，已知丰富很高。初次做一定要结合WB来看，SDS-PAGE看丰富和纯度，WB看表达与否以及位置大小是否正确

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4楼2018-09-19 05:58:14
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奋斗的小菇凉

新虫 (初入文坛)
你好，请问你的pESC载体能和我换个载体吗？

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6楼2018-10-15 14:20:37
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
我用的pESC-URA载体，也遇到你这样的问题了

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8楼2018-11-25 09:19:30
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北川赏雪

金虫 (小有名气)
同问，我这个是pESC-HIS载体，PCR验证质粒转进去了，就是30摄氏度，140rpm, D-半乳糖诱导不生长，不知道哪有问题
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世界是可以理解的。——爱因斯坦
9楼2020-05-17 12:30:09
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北川赏雪

金虫 (小有名气)
补充可以看看这个https://www.thermofisher.com/cn/ ... etting-started.html
Some researchers choose to grow yeast in medium containing 2% galactose as the sole carbon source during induction. However, yeast typically grow more quickly in induction medium containing 2% galactose plus 2% raffinose. Raffinose is a good carbon source for yeast, and unlike glucose, does not repress transcription from the GAL promoter. Raffinose is a trisaccharide of galactose, glucose, and fructose linked in that order. Most yeast can cleave the glucose-fructose bond, but not the galactose-glucose bond. Fructose is then used as a carbon source.也有见过加甘油和半乳糖。
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世界是可以理解的。——爱因斯坦
10楼2020-05-17 12:49:45
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普通回帖

鱼蛋鱼蛋

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
2楼2018-09-19 00:09:11
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silence0919

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鱼蛋鱼蛋 at 2018-09-19 00:09:11
可以试一下醋酸锂酵母转化法
...

转化没有问题应该。诱导表达有问题。转化用的试剂盒，效率很高。

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3楼2018-09-19 00:10:25
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Ljiancai

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by silence0919 at 2018-09-19 00:10:25
转化没有问题应该。诱导表达有问题。转化用的试剂盒，效率很高。
...

楼主，请问您的问题解决了吗？我遇到和你同样的问题，能不能给些建议，
不胜感激
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5楼2018-10-10 17:16:17
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若5129cmm

新虫 (初入文坛)
楼主，问题解决了吗？本人遇到了相同的问题

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7楼2018-10-27 10:13:02
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