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急！酵母中半乳糖诱导表达
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最近用BY4741转化pESC-Leu载体做表达， 在SD缺Leu的培养基上筛选，2天后能够看到大量很明显的转化子（用加水的BY4741感受态做对照不长）。但是用半乳糖诱导，破菌后SDS-PAGE跑上清沉淀，看不到目的蛋白，空载体和质粒跑得SDS-PAGE差不多结果。初步推测应该是没有诱导成功。尝试过下列几种诱导方式： 1.SD培养基上转化子转到YPD培养基摇过夜， 转移到大量YPD培养基再次摇过夜，离心得到菌体再转移到YPG培养基上，16度诱导过夜。其中OD600监测不低于0.6. 2.转化子转到液体SD培养基摇过夜，离心，菌体中加入SG培养基诱导过夜 3.转化子 接到SD（无galactose）, YP(无galactose)两种培养基中分别培养1小时后，加棉子糖和galactose做诱导培养 诱导温度都是16度过夜，也试过一次25度6小时 基本上都看不到目的蛋白~ 求助大神 到底是哪里除了问题？或者是不是需要做western验证？ 请各位不吝赐教，感激不尽~~~ |
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BY4741是单倍体？很久不做酵母了，以前用过BY4743。一缺长，看上去转进去了，不能只用SDS-PAGE来检测，无论哪个表达系统，因为不知道表达的丰富如何，除非是别人做过，已知丰富很高。初次做一定要结合WB来看，SDS-PAGE看丰富和纯度，WB看表达与否以及位置大小是否正确 发自小木虫Android客户端 |
4楼2018-09-19 05:58:14
6楼2018-10-15 14:20:37
张凡云
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8楼2018-11-25 09:19:30
北川赏雪
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9楼2020-05-17 12:30:09
北川赏雪
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补充可以看看这个https://www.thermofisher.com/cn/ ... etting-started.html Some researchers choose to grow yeast in medium containing 2% galactose as the sole carbon source during induction. However, yeast typically grow more quickly in induction medium containing 2% galactose plus 2% raffinose. Raffinose is a good carbon source for yeast, and unlike glucose, does not repress transcription from the GAL promoter. Raffinose is a trisaccharide of galactose, glucose, and fructose linked in that order. Most yeast can cleave the glucose-fructose bond, but not the galactose-glucose bond. Fructose is then used as a carbon source.也有见过加甘油和半乳糖。 |
10楼2020-05-17 12:49:45
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本帖内容被屏蔽 |
2楼2018-09-19 00:09:11
3楼2018-09-19 00:10:25
Ljiancai
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5楼2018-10-10 17:16:17
7楼2018-10-27 10:13:02