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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 一直找不到亚克隆
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fast-rui

新虫 (小有名气)

[交流] 一直找不到亚克隆 已有4人参与

本人从今年三月开始就一直在做亚克隆的实验，但是一直没有找到。阳性克隆部分酶切切取2-4k片段和制备好的载体用T4DNA连接酶连接，然后电转，转化后涂板子。培养基里加有抗生素，照理说长不出几个克隆，可是每次涂完板子就有100-200个单菌落，从中任意挑取几个单菌落摇菌，出现过以下几种情况：1.摇不浓 2.摇的浓提质粒跑胶检测，发现一管质粒都提不出来  3.摇的浓提质粒跑胶检测，15管里提出1管，做双酶切验证发现不是我要的亚克隆。  重复了好多好多次，不知道是哪一步出了问题，请高手指点一下，不胜感激！

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1楼 2018-09-03 16:58:54
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
总有些事情是莫名其妙的，做多几次就好了，我也不知道是什么原因。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2018-09-03 20:00:58
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fast-rui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2018-09-03 20:00:58
总有些事情是莫名其妙的，做多几次就好了，我也不知道是什么原因。

好的，谢谢。

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3楼2018-09-04 16:26:45
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peaker哈哈

新虫 (初入文坛)
★ ★
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小冀-: 金币+1, 鼓励回帖 2018-09-04 20:44:47
可能是酶切没有切断，也可能是连接没有连接上，一个一个的排除吧，我最近也在做，也是连不上，初步判定可能是酶有问题，还在等酶回来呢
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4楼2018-09-04 17:11:37
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
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引用回帖:
3楼: Originally posted by fast-rui at 2018-09-04 16:26:45
好的，谢谢。
...

我曾经同时克隆7个基因至30a载体，载体双酶切是没有问题的，因为是双酶切一个连接了外源基因的质粒；外源基因由于是PCR得到的，无法检验双酶切效果，但花了一个月做了3次都没有成功，也就是说是失败了7*3=21次/个，这就不知道问题出在哪里了。期间感受态细胞换了3批，外源基因换了3次，内切酶没有换，培养温度从37换到30，连接酶没有换。第二个月什么都没有换，一下子就成功了5个基因，所以我也不知道是什么原因。
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5楼2018-09-04 21:22:32
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fast-rui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2018-09-04 21:22:32
我曾经同时克隆7个基因至30a载体，载体双酶切是没有问题的，因为是双酶切一个连接了外源基因的质粒；外源基因由于是PCR得到的，无法检验双酶切效果，但花了一个月做了3次都没有成功，也就是说是失败了7*3=21次/个， ...

哈哈，微生物的实验都很玄乎，说不出个所以然。这个亚克隆我已经做了五个月了，阳性克隆质粒的部分酶切还有载体的制备都没有问题，连接的话也是按照t4DNA连接酶的说明书来设置反应体系的量的，照理说也没问题。感受态细胞也换了有三批了。就一直重复不出来。好玄乎。我最近在想是不是用的培养基有问题，不应该用LB的

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6楼2018-09-04 22:16:35
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fast-rui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by peaker哈哈 at 2018-09-04 17:11:37
可能是酶切没有切断，也可能是连接没有连接上，一个一个的排除吧，我最近也在做，也是连不上，初步判定可能是酶有问题，还在等酶回来呢

我都怀疑我酶切的片段大小问题了，今天也有考虑试试切小一点的片段

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7楼2018-09-04 22:17:50
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clark2010

金虫 (小有名气)
★
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你先测试一下你的感受态细胞的抗生素抗性，我怀疑是感受态细胞就污染了。
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8楼2018-09-05 12:20:43
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xinxinjin

银虫 (知名作家)
解释不了

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9楼2019-06-16 13:09:05
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