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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于SDS-PAGE电泳图谱分析的疑问
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annsp

金虫 (正式写手)

[交流] 关于SDS-PAGE电泳图谱分析的疑问

我有一张SDS-PAGE电泳图谱，颜色深的是我的目标表达蛋白。我点样之前定过蛋白，点样的时候保证的是总蛋白一样，所以有些样的点样量只有1.3μl。可最后的结果，貌似是有些样的总蛋白浓度太少了吧。是不是从图上一眼就能看出总蛋白不一致啊？可问题是颜色浅的样正好是我点样量少的样，请问这是怎么回事？定蛋白的时间跟加完loding buffer的间隔有2小时（期间蛋白一直在冰上），蛋白会降解的那么快么？
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1楼 2009-03-31 21:30:15
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sutao1979

木虫 (著名写手)

小木虫10年groupleader
差别是有点过于明显，一看就让人判断上样量不均匀，不知道你的定量是怎么定量的，是浓度测定还是用control直接加等量？一般表达和control都是同一条件培养，然后上样均等再作比较的啊。
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会当凌绝顶，一览众山小
2楼2009-03-31 22:25:34
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annsp

金虫 (正式写手)
我是先测了蛋白浓度，然后取点样量和蛋白浓度乘积相等，这样点的样总蛋白应该一样吧
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3楼2009-04-01 09:46:26
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xl-ray

金虫 (小有名气)
从你的图中可以看出几个泳道中的总蛋白量有明显的差别，你定量后上样有没有扣除lording buffer的稀释？因为上样量太少不利于准确定量。
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4楼2009-04-01 17:15:55
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yidiankucao

铁虫 (初入文坛)
Loading buffer稀释不均匀，取得上清中蛋白量最少，特别是上了1.3μl的样，根本不能保证它的量。要定量最好让他们上样的体积稍大些，这样保证最浓的蛋白也能上到5-8μl，这样的偏差能少些。 对于蛋白降解，两个小时按说也没有那么快。但还是定完量跑电泳，就直接做了更放心。
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5楼2009-04-01 23:11:18
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yidiankucao

铁虫 (初入文坛)
Loading buffer稀释不均匀，取得上清中蛋白量最少，特别是上了1.3μl的样，根本不能保证它的量。要定量最好让他们上样的体积稍大些，这样保证最浓的蛋白也能上到5-8μl，这样的偏差能少些。 对于蛋白降解，两个小时按说也没有那么快。但还是定完量跑电泳，就直接做了更放心。
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6楼2009-04-01 23:11:48
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
对对，体积越小误差越大，所以还是稀释了上大体积比较好，浓度测的时候也要注意体积的影响。
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金币是赌出来的
7楼2009-04-02 09:05:57
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恒星年

银虫 (正式写手)
体积太小了，误差会比较大的。
顺便问一下，你用的是什么marker？什么公司的啊？
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8楼2009-04-02 15:31:06
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anik

银虫 (正式写手)
是用银染还是考染？银染不能用来定量。。。
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9楼2009-04-02 18:39:57
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annsp

金虫 (正式写手)
明白了，我再试试，谢谢
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10楼2009-04-02 21:17:20
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