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LR反应，测序总是不对，表达载体构建反复失败，这是为什么？
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各位大神大家好， 微生物菜鸟一枚。最近在LR这失败了两个月， 都没有找到原因， 我的入门载体是PGWC，已连接好我的CDS进行了测序，现在我通过gateway技术将我的基因从入门载体LR到表达载体 送测序了大概7.8次，我有6个表达载体都需要构建 测序结果 ： 头两次是测序公司打电话说细胞壁没办法裂解，没法提质粒，我自己从过去质粒他说我质粒无信号，我用自己克基因引物测的 后来又送了两批，送的菌液，结果是测序失败。我自己提质粒 这边我就提不出来了 测序公司打电话说怀疑是污染，用自己克基因引物测的 用了别人提的表达载体质粒 又送过去了一波，测序成功了 相似度百分之20多，不是我的东西， 用PGWB表达载体通用引物测序的 我又用了买的DH5感受态，又送过去了一波， 测序显示有重叠峰，我把测序结果到NCBI上比对了一下，发现是我的表达载体的序列。 现在不知道怎么办了 ，等着载体成功后转农杆菌呢，这重复无意义的工作，还没有找到原因。烟草都种了好几批了，请问问题出在哪，我应该怎么办 跪谢 |
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凌儿凌夷
铜虫 (小有名气)
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3楼2018-11-01 08:06:56
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2楼2018-10-28 13:55:40
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前面两次你都是用你自己的特异性引物进行测序的，无信号的话就证明是空载了，后面是你的表达载体序列那么还是空载，或者你的载体改造过，建议你先做个TA克隆看下 发自小木虫Android客户端 |
4楼2018-11-01 10:32:08
5楼2018-11-05 16:22:15