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ZYJLL

新虫 (小有名气)

[求助] BamH1和MluI双酶切 已有2人参与

求助!本人纯分子克隆的小白,但是不好意思所有的问题都问师兄师姐,还望各种虫友相助!
最近用BamH1和MluI双酶切,都是NEB的HF省时酶,cusmart缓冲液,公司说明书上说这两种酶在cusmart中效率为100%,但是我现在的载体根本切不开,我在网上查的MluI这个酶效率比较低,不加保护碱基时效率为0,有保护碱基50.我的insert加了保护碱基,可是载体是公司买的没有保护碱基,分别试了双酶切2小时和7小时,但是最后的没有阳性克隆,各位大神帮忙分析一下是怎么回事呀!

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莫落

木虫 (正式写手)

载体怎么会没有保护碱基呢

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2楼2018-07-17 18:44:40
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草哥cium

新虫 (正式写手)

都载体了...都是保护性碱基

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3楼2018-07-18 00:21:54
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-07-26 22:21:42
ZYJLL: 金币+2, ★★★很有帮助 2018-07-29 16:02:24
我们用过NEB的MluI限制性内切酶,感觉酶切效果还不错,所谓的保护性碱基就类似于作为限制性内切酶的支撑点(好像是这样的哈),并不只有网上查的那些碱基才能作为保护性碱基,大部分酶切位点两边有碱基,酶切效率都不会太差。。。
4楼2018-07-18 11:36:04
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macgray11

禁虫 (小有名气)

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-07-26 22:21:56
ZYJLL: 金币+2 2018-07-29 16:02:55
本帖内容被屏蔽

5楼2018-07-18 12:26:44
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ZYJLL

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by cry_2013 at 2018-07-18 11:36:04
我们用过NEB的MluI限制性内切酶,感觉酶切效果还不错,所谓的保护性碱基就类似于作为限制性内切酶的支撑点(好像是这样的哈),并不只有网上查的那些碱基才能作为保护性碱基,大部分酶切位点两边有碱基,酶切效率都 ...

多谢多谢!之前一直怀疑这个酶效率有问题,现在正在单酶切

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6楼2018-07-19 10:42:41
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ZYJLL

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by macgray11 at 2018-07-18 12:26:44
建议分别单切跑胶看看哪个酶有问题,如果都没切开可以考虑buffer,或者载体的问题

多谢!昨天单酶切,先BamH1切的,然后回收了600多ng,又mlui酶切过夜,结果第二天没有条带了,现在先mlui切一下,看看这个酶有没有问题

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7楼2018-07-19 10:44:22
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ZYJLL

新虫 (小有名气)

刚刚懂啦!多谢!载体上肯定有保护碱基

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8楼2018-07-19 10:45:43
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ZYJLL

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by macgray11 at 2018-07-18 12:26:44
建议分别单切跑胶看看哪个酶有问题,如果都没切开可以考虑buffer,或者载体的问题

然后我的载体的两个酶切位点相差20多bp,载体是公司构建好送过来的

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9楼2018-07-19 10:49:00
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ZYJLL

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by ZYJLL at 2018-07-19 10:42:41
多谢多谢!之前一直怀疑这个酶效率有问题,现在正在单酶切
...

那你们切了多久呀,也是HF嘛

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10楼2018-07-19 10:49:40
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