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哒哒哒小马蹄

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体连接与表达 已有1人参与

我扩一个1400bp的猪的基因,从cdna上扩,用了1*pfu,primerstar,还有擎科生物的高保真都没扩出来,然后用了三段式融合pcr,扩出了正确的条带,然后连接pegfpc3载体后也表达了,由于放假就没有接着做细胞实验。开学又用此质粒去转化出一批新的质粒,一直测序,反复突变,换了两家测序公司还是这样,我是选择重新扩还是怎样啊,求助,而且想知道为什么会反复突变?
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渊博震天

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【答案】应助回帖

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如果是用先前连接pegfpc3正确的重组质粒去抽提之后再测序的话,基本可以排除突变了。因为生物体内的突变率很低,怀疑是不是测序公司的技术问题?
2楼2018-07-10 12:36:47
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a13515517892

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-07-10 12:36:47
如果是用先前连接pegfpc3正确的重组质粒去抽提之后再测序的话,基本可以排除突变了。因为生物体内的突变率很低,怀疑是不是测序公司的技术问题?

你的这个回答感觉不合理,一家公司技术有问题还能测出来质粒突变啊,既然测序技术有问题可以突变,那菌株本身也可以突变吧,何况换了两家公司,都是反复突变。

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3楼2018-07-10 13:04:05
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a13515517892

木虫 (小有名气)

我就想问开始扩出来连载体的质粒有测序吗,如果没有,你咋知道不存在突变的。

发自小木虫IOS客户端
4楼2018-07-10 13:05:11
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渊博震天

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引用回帖:
3楼: Originally posted by a13515517892 at 2018-07-10 13:04:05
你的这个回答感觉不合理,一家公司技术有问题还能测出来质粒突变啊,既然测序技术有问题可以突变,那菌株本身也可以突变吧,何况换了两家公司,都是反复突变。
...

每次测序返还回来的结果显示都是一个地方突变咩?
5楼2018-07-10 13:05:54
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a13515517892

木虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 渊博震天 at 2018-07-10 13:05:54
每次测序返还回来的结果显示都是一个地方突变咩?...

个人认为他这个实验开始做的就存在问题,拿到的质粒没有说是否测序,个人感觉他估计是看到条带对了,克隆做了有表达就没测序验证质粒是否正确,现在要做下游实验了抽质粒测序突然发现质粒不对了,而且是反复的突变,估计已经懵了。
6楼2018-07-10 13:16:45
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渊博震天

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引用回帖:
6楼: Originally posted by a13515517892 at 2018-07-10 13:16:45
个人认为他这个实验开始做的就存在问题,拿到的质粒没有说是否测序,个人感觉他估计是看到条带对了,克隆做了有表达就没测序验证质粒是否正确,现在要做下游实验了抽质粒测序突然发现质粒不对了,而且是反复的突变 ...

估计是这样的

发自小木虫Android客户端
7楼2018-07-10 14:20:28
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)


8楼2018-07-10 14:43:13
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ghst110

银虫 (正式写手)

测序是不会产生突变的,因为测序中有少量的杂峰是可以排除的。所以突变产生环节在构建质粒以及之前。另外,LZ说反复突变是什么意思,不同家测序在相同位点的结果不一样吗?
*才随遇长,识以穷精*
9楼2018-07-10 16:30:49
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